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Amperometric detection of hormonal activity by a yeast cell biosensor

  • The widespread use of natural and synthetic estrogens or chemicals with estrogenic activities is causing an increasing accumulation of estrogenic compounds in the environment. Already at very low concentrations these estrogenics can severely affect the wildlife, particularly in an aquatic environment. For these reasons measuring devices for detecting estrogen contaminations are in great demand. The majority of the analytical methods and bioassays on the market so far, lack semi-online adaptability, and usually cannot be used for automatic and continuous determination. Therefore, we have embarked on the development of new systems, which are able to fulfil those demands. The EstraMonitor combines recombinant A. adeninivorans G1212/YRC102-hERa-phyK yeast cells as the microbial component with an amperometric detection method to analyze estrogenic contaminations. A. adeninivorans G1212/YRC102-hERa-phyK was constructed by Kaiser et al. (2010). These cells were engineered to co-express the human estrogen receptor (hERa) gene and the inducible phytase (phyK, derived from Klebsiella sp. ASR1) reporter gene under control of a promoter with estrogen response elements (EREs). In the presence of estrogenic substances, such as 17ß -estradiol (E2), the phyK gene is expressed and recombinant phytase is secreted into the media. The level of phytase is quantified by amperometric detection using substrate p-aminophenyl phosphate (p-APP). Phytase dephosphorylates p-aminophenyl phosphate (p-APP) into an intermediate product p-aminophenol (p-AP). p-AP is electroactive and oxidized at the electrode. This generates electrons and produces a current which is proportional to the level of phytase activity. Since phytase activity is directly correlated to the E2 concentration, the estrogenic activity can thus be calculated from the current measured. The microbial component of the EstraMonitor, the non-immobilized A. adeninivorans G1212/YRC102-hERa-phyK, works well with the amperometric method in a quantitative manner. The optimal applied potential determined for amperometric measurements was 150 mV and provided a low background signal for the amperometric detection. The half maximal effective concentration (EC50) and limit of detection (LoD) values for E2 obtained from amperometric measurements with the EstraMonitor were 69.9 ng L-1 and 44.5 ng L-1, respectively. The measuring procedure of the EstraMonitor system including incubation of A. adeninivorans G1212/YRC102-hERa-phyK cells with E2, subsequently incubation with electrochemical substrate (p-APP), and signal recordation is completed within only 4 h and 10 min. Out of this total time, amperometric detection including substrate incubation and signals recordation takes only 10 min out of total time. The use of immobilized cells for a microbial biosensor is an essential advantage of the EstraMonitor system because it allows easy-handiness next to long-term stability and reusability. Immobilized A. adeninivorans G1212/YRC102-hERa-phyK cells revealed excellent properties which make them very suitable for semi-online, automatic and continuous monitoring. They were stable up to 30 days when stored at 4 °C. Furthermore, they could be reused up to 15 times. The EC50 and LoD values achieved for E2 using immobilized cells in combination with amperometric detection were 20.9 and 8.3 ng L-1, respectively. Furthermore, this application also removes the need to separate cells by centrifugation, to sterilize the samples as well as to cultivate repeatly. Additionally, both immobilized and non-immobilized A. adeninivorans G1212/YRC102-hERa-phyK cells remain fully functional in a wide range of untreated wastewater samples and in environments containing up to 5% NaCl. To enhance the sensitivity and reduce the time for estrogenic determination, an alternative A. adeninivorans G1214/YRC103-hERa-phyK strain was developed. This strain can produce a detectable amount of phytase within 2 h after induction with E2. It offers an improved microbial component in terms of sensitivity and time-effectiveness. In addition, to reduce the cost for estrogenic detection an alternative substrate, ascorbic acid 2-phosphate (AA2P), was tested. AA2P, which is both cheap and widely available, performed better than p-APP. The EC50 and LoD values for E2 obtained with AA2P were 15.69 and 0.92 ng L-1 versus 20.09 and 8.3 ng L-1 when examined with p-APP, respectively. Taken together, the EstraMonitor is an automated system with respect to sample cycling, sample measuring and calibration supplemented with an alarm function. This system makes it possible to control estrogenic activity semi-online, automatically and continuously. These are advantages of the EstraMonitor compared to other estrogenic detection systems. It can thus be concluded that, the EstraMonitor is a powerful and feasible semi-online device for monitoring estrogenic activity especially adapted for the use in sewage treatment plants.
  • Durch den ständig steigenden Einsatz von natürlichen und synthetischen Östrogenen bzw. Chemikalien mit östrogener Wirkung, kommt es heutzutage vermehrt zu Umweltbelastungen insbesondere für aquatisch lebende Organismen. Um auf derartige steigende Umweltbelastungen Einfluss nehmen zu können, war die Entwicklung eines geeigneten Nachweisverfahrens notwendig, welches die Nachteile bereits existierender Analyseverfahren und Bioassays zum Nachweis östrogener Verbindungen, beispielsweise bei der Automatisierung bzw. der kontinuierlichen Messung, verbessert. Ziel dieser Arbeit war die Etablierung eines für die semi-online Messungen ausgelegten Messverfahrens zur Bestimmung von östrogen-wirksamen Substanzen. Dieses neue Messsystem, EstraMonitor, ist eine Kombination aus transgenen A. adeninivorans Hefezellen (G1212/YRC102-hERa-phyK) als mikrobieller Komponente und einer amperometrischen Messeinheit für östrogene Aktivität. Die Hefezellen (Kaiser et al., 2010) co-exprimieren den humanen Östrogen-Rezeptor (hERa), sowie eine rekombinante Phytase (phyK, aus Klebsiella sp. ASR1) als Reporter, deren Gen unter Kontrolle eines induzierbaren Promotors mit Östrogen-Response-Elementen (ERE) steht. Damit sezernieren die transgenen Hefezellen in Gegenwart von östrogen-wirksamen Substanzen rekombinante Phytase in das Medium, wo sie als Substrat zugegebenes p-Aminophenylphosphat (p-APP) dephosphoryliert. Die Oxidation von p-Aminophenol (p-AP) wiederum setzt proportional zur Phytaseaktivität Elektronen frei, die sich amperometrisch messen lassen. Auf diese Weise kann über die Phytaseaktivität die Konzentration an östrogen-wirksamen Substanzen im Probenmaterial berechnet werden. Für amperometrische Messungen mit nicht-immobilisierten A. adeninivorans G1212/YRC102-hERa-phyK Zellen wurde 150 mV als optimales Potential ermittelt. Die damit gemessenen EC50 und LoD Werte lagen für 17-Estradiol (E2) bei 69,9 ng L-1 bzw. 44,5 ng L-1. Sie ließen sich mit einem kommerziellen Poteniostat (Palmsens) bestätigen (78,1 ng L-1 bzw. 43,9 ng L-1). Das gesamte Prozedere des EstraMonitor Verfahrens kann innerhalb von nur ca. 4 h abgeschlossen werden. Um die Handhabbarkeit, Langzeitstabilität und Wiederverwendbarkeit der mikrobiellen Sensorkomponente zu verbessern, wurden immobilisierte Hefezellen eingesetzt. Damit entfielen Arbeitsschritte wie Sterilisation, Kultivierung und Zentrifugation, was für eine semi-online, automatische und kontinuierliche Überwachung von z.B. Kläranlagen essentiell ist. Im Rahmen dieser Arbeit wurde ermittelt, dass immobilisierte A. adeninivorans G1212/YRC102-hERa-phyK Zellen bei 4 °C bis zu 30 Tage stabil sind und bis zu 15 mal wieder verwendet werden können. Die amperometrisch detektierten EC50 und LoD Werte für E2 lagen bei 20,9 und 8,3 ng L-1. Erste Realprobenmessungen mit E2 belasteten, nicht-vorbehandelten Abwasserproben belegten, dass die A. adeninivorans G1212/YRC102-hERa-phyK Zellen aufgrund ihrer relativ hohen Salztoleranz bis zu einer Konzentration von 5% NaCl einsetzbar sind. Damit lässt sich der EstraMonitor zum Nachweis östrogener Aktivität im Abwasser ohne Vorbehandlung, Extraktion, Konzentration und Sterilisation der Proben einsetzen. Um die Sensitivität der Nachweismethode, sowie vor allem deren Analysezeit weiter zu verkürzen, wurde im Rahmen dieser Arbeit mit A. adeninivorans G1214/YRC103-hERa-phyK eine neue mikrobielle Sensorkomponente konstruiert und damit erste Tests durchgeführt. Mit ihr ließ sich bereits nach 2-stündiger E2-Inkubation ein entsprechendes Messsignal detektieren. Damit konnte mit diesen verbesserten transgenen Hefezellen das Einsatzgebiet des EstraMonitors erweitert werden. Darüber hinaus war es ebenfalls möglich, die Kosten der Messmethode zu senken, indem das kostengünstigere Substrat Ascorbinsäure 2-phosphat (AA2P) eingesetzt wurde. Die damit erreichten EC50 und LoD Werte für E2 mit 15,69 und 0,92 ng L-1 waren im Vergleich zum bisher genutzten Substrat p-APP (20,09 und 8,3 ng L-1) sensitiver. Insgesamt kann festgestellt werden, dass der EstraMonitor ein komplett automatisiertes System zur Probenanalyse einschließlich Mess- und Kalibrier-Prozessen, sowie einer Alarmfunktion ist. Er bietet erstmals die Möglichkeit zur sensitiven, kostengünstigen, schnellen, automatischen und kontinuierlichen semi-online Kontrolle der östrogenen Aktivität, beispielsweise an Kläranlagen.

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Metadaten
Author: Thi Minh Ha Pham
URN:urn:nbn:de:gbv:9-001312-4
Title Additional (German):Amperometrische Detektion von hormonaler Aktivitaet mittels eines Hefe basierten Biosensors
Advisor:Prof. Dr. habil. Rüdiger Bode, Prof. Dr. habil. Gotthard Kunze
Document Type:Doctoral Thesis
Language:English
Date of Publication (online):2012/10/04
Granting Institution:Ernst-Moritz-Arndt-Universität, Mathematisch-Naturwissenschaftliche Fakultät (bis 31.05.2018)
Date of final exam:2012/06/15
Release Date:2012/10/04
Tag:Amperometrische Detektion; EstraMonitor
Amperometric detection; EstraMonitor
GND Keyword:Biosensor, Hefeartige Pilze, Östrogen-Rezeptor-Modulator, Östrogene
Faculties:Mathematisch-Naturwissenschaftliche Fakultät / Institut für Chemie und Biochemie
DDC class:500 Naturwissenschaften und Mathematik / 540 Chemie