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Röntgenkristallographische Analyse zur Bestimmung von Struktur-Funktionsbeziehungen zur toxischen Metalloendopeptidase AsaP1 sowie zur Haloalkan Dehalogenase DppA

  • Metalloendopeptidase AsaP1 Die extrazelluläre Metalloendopeptidase AsaP1 wird als Zymogen exprimiert. Sie ist hoch immunogen und hauptsächlicher Virulenzfaktor von einigen atypischen Aeromonas salmonicida Stämmen, die als Krankheitserreger bei einer Vielzahl von Fischarten atypische Furunkulose auslösen. Die Krankheit besitzt das Potential für eine schnelle Ausbreitung und verläuft oftmals tödlich. Der Ausbruch in Aquakulturen kann zur völligen Ausmerzung der Fischbestände führen. In dieser Arbeit wurden inaktive Mutanten von AsaP1, die noch in der Lage sind eine Immunantwort hervorzurufen, exprimiert, gereinigt, kristallisiert und mittels Röntgenkristallographie strukturell charakterisiert. Erstmalig kann die Struktur der Propeptid-Domäne von M35-Deuterolysin oder Aspzinkin-Proteasen gezeigt werden, deren Prozessierungsmechanismus – im Gegensatz zu anderen Proteasefamilien – bisher noch nicht aufgeklärt werden konnte. Die Interaktion von Propeptid und Protease erlaubt Rückschlüsse auf die Substratspezifität. Spezifische Wechselwirkungen in der S1strich-Bindetasche sprechen für eine Lysinspezifität der Protease. Aufgrund von Inaktivität der kristallisierten Mutanten konnte höchst wahrscheinlich ein Intermediat der autoproteolytischen Prozessierung der Protease erfasst werden. Strukturell weist das AsaP1-Propeptid Ähnlichkeit zu einem Protease-Inhibitor aus B. subtilis, dem FixG-related Protein und ApaG-Proteinen auf, deren Funktion noch nicht ermittelt werden konnte. Inwiefern die Ähnlichkeiten in der Struktur auf eine gemeinsame Funktion deuten, kann zurzeit nicht beantwortet werden. DppA Haloalkan Dehalogenase Haloalkan Dehalogenasen (HDs) spalten die Kohlenstoff-Halogen-Bindung halogenierter aliphatischer Kohlenwasserstoffe. Als einziges Co-Substrat wird Wasser benötigt. Bisher charakterisierte Haloalkan Dehalogenasen (HDs) gehören strukturell zur Familie der alpha/beta-Hydrolasen und werden weiterhin unterteilt aufgrund der Position und Identität funktionell wichtiger Aminosäurereste. Enzyme mit Asp–His–Asp (katalytische Triade) und Trp–Trp (Halogenid-stabilisierende Aminosäuren) zählen zu HDs-I, mit Asp–His–Glu und Asn–Trp zu HDs-II oder mit Asp–His–Asp und Asn–Trp zu HDs-III. Die Substratspezifität von HDs wird hauptsächlich durch die Cap-Struktur gegeben, die die Beschaffenheit des Ein- und Ausgangstunnels und die des aktiven Zentrums bestimmt. Zurzeit sind fünf HDs strukturell beschrieben und weitere Information zu Struktur-Funktionsbeziehungen von Haloalkan Dehalogenase bieten zusätzliche Möglichkeiten zur Optimierung und Umsetzung gewünschter Reaktionsschritte durch gerichtetes Proteindesign der Cap-Struktur.
  • AsaP1 AsaP1 is a M35 aspzincin metalloendopeptidase that is expressed as a precursor. The extracellular toxic metalloendopeptidase is secreted by the fish pathogen Aeromonas salmonicida subsp. achromogenes and causes atypical furunculosis in many fish species. The desease is able to spread fast and often ends in death of infected organisms and an outbreak in aquaculture might lead to a complete eradication of fish stocks. In this work, inactive mutants of AsaP1 that are still able to induce a immune response, were heterologous expressed, purified, crystallized and structurally analysed by means of X-ray crystallography. For the first time a precursor of deuterolysin-like aspzincin proteases is characterized on a structural level. The interaction of protease and propeptide gives insights into substrate binding and protease specificity. Specific interactions within the S1´binding pocket indicate a lysine-specificity of AsaP1. Haloalkane dehalogenase DppA Haloalkane dehalogenases are alpha/beta-hydrolase fold enzymes that catalyze the hydrolytic conversion of a broad spectrum of halogenated alkanes to the corresponding alcohols. This reaction is of great environmental interest and haloalkane dehalogenases have therefore been extensively studied in recent years. Attempts have been made to enhance the speed of the catalytic reaction, to expand the substrate range and to increase the enantioselectivity. HLDs were subdivided into three subfamilies HLD-I, HLD-II, and HLD-III according to their substrate specificity on one hand, and the position of functionally important residues on the other hand: Asp–His–Asp (catalytic triad) and Trp–Trp (halide-stabilizing residues) in HLD-I, Asp–His–Glu and Asn–Trp in HLD-II, and Asp–His–Asp and Asn–Trp in HLD-III. The substrate specificity of halolkane dehalogenases is typically influenced by their cap-domain, that alters the nature of entrance tunnels and that of the active site. Today, there are five structures of halolkane dehalogenases available. Further knowledge of structure-function relationships is a great means for rational protein design and enzyme engeneering for optimization and change of the substrate range.

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Metadaten
Author: Xenia Bogdanovic
URN:urn:nbn:de:gbv:9-001338-0
Title Additional (English):X-ray crystallographic analysis of the toxic metalloendopeptidase AsaP1 and of the haloalkane dehalogenase Dppa
Advisor:Prof. Dr. Winfried Hinrichs
Document Type:Doctoral Thesis
Language:German
Date of Publication (online):2012/11/16
Granting Institution:Ernst-Moritz-Arndt-Universität, Mathematisch-Naturwissenschaftliche Fakultät (bis 31.05.2018)
Date of final exam:2012/06/14
Release Date:2012/11/16
Tag:Aspzinkin, Haloalkan Dehalogenase
GND Keyword:-Enzym, Kristallographie
Faculties:Mathematisch-Naturwissenschaftliche Fakultät / Institut für Chemie und Biochemie
DDC class:500 Naturwissenschaften und Mathematik / 540 Chemie