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Vermehrung und Analyse des abnormalen Prion-Proteins mit Hilfe der protein misfolding cyclic amplification

  • Die „protein misfolding cyclic amplification“ (PMCA) ist eine Methode zur Amplifikation des pathologischen Prion-Proteins in vitro und ermöglicht so den hochsensitiven Nachweis von PrPSc-Molekülen. Ziel der vorliegenden Arbeit war es, diese neue Untersuchungsmethode zum Nachweis des BSE-Erregers zu adaptieren, verschiedene Erregerstämme zu charakterisieren und unterschiedliche Gewebeproben aus der Pathogenese-Studie des FLI (HOFFMANN et al. 2007) auf ihren Priongehalt zu testen. Durch Festlegung von Standardwerten für die Ultraschallbehandlungen im Hinblick auf Zyklenzahl, Schallstärke, Inkubationstemperatur und Zyklusdauer sowie Verwendung definierter negativer als auch positiver Kontrollen, konnte die PMCA erfolgreich angepasst werden. Verwendet wurde als Substrat Hirnhomogenat transgener Mäuse, die das bovine PrPC überexpremieren (Tgbov XV). Bei Untersuchungen von Gewebeproben von insgesamt 4 Rindern aus der Pathogenesestudie konnte PrPSc in folgenden Gewebetypen nachgewiesen werden: dem dorsalen Root-Ganglion, dem Ganglion coeliacum, dem Ganglion stellatum, dem Ganglion trigeminale, der caudalen Medulla, den jejunalen und ilealen Peyer´schen Platten, dem Kolon, dem ilealen und jejunalen mesenterialen Lymphknoten, dem Nervus opticus, den Nebennieren, dem Rectum und dem Rückenmark und erstmals auch im Labmagen, dem Oesophagus und dem Pansen. Die PMCA wurde ebenso für die Untersuchung zur Speziesbarriere eingesetzt. Dazu wurden verschiedene TSE-Stämme (klassische BSE, atypische BSE, klassische Scrapie, ovine und caprine BSE sowie CWD) in unterschiedlichen Substraten mit bovinem und ovinem PrPC amplifiziert. Die Ergebnisse zeigen, dass die Speziesbarriere eine verringerte Amplifikationseffizienz in vitro verursachte und teilweise die Amplifikation vollständig inhibierte. Zusätzlich wurde beobachtet, dass die Amplifikationseffizienz nicht nur von der Sequenzhomologie bestimmt wird, sondern auch von der Konformation der eingesetzten Isolate. Dies korreliert mit der erleichterten Infizierbarkeit von Individuen gleicher Art im Gegensatz zu der verringerten Übertragbarkeit zwischen artfremden Spezies (Speziesbarriere). Die mangelnde Umfaltungs-Effizienz ist eine Folge von Spezies-spezifischen Sequenzunterschieden im Prion-Protein und daraus resultierender Strukturunterschiede. Einen Hinweis auf ein verändertes Verhalten der Seeds in vivo und in vitro wurde bereits in der Literatur beschrieben. Intrazerebral infizierte Hamster, die mit einem in der PMCA amplifizierten Seed inokuliert wurden bewiesen, dass das neu gebildete PrPres infektiös war, da sich bei den Tieren nach etwa 165 Tagen, post infektionem, klinische Symptome für eine Scrapieerkrankung zeigten (CASTILLA et al. 2005). Wurden die Hamster aber direkt mit einem Hamster-Scrapie-Stamm der Variante 263K inokuliert, erkrankten diese schon nach 60 Tagen (KIMBERLIN et al. 1977), was auf eine Veränderung der PrPres-Fragmente während der PMCA-Reaktion hindeutet. Eine vergleichbare Studie zeigte, dass sich diese Ergebnisse bei intrazerebraler Inokulation in Mäusen reproduzieren lassen (WEBER et al. 2007). In der PMCA konnten also PrPres-Amplifikate mit veränderten biochemischen Eigenschaften generiert werden. Zukünftige Arbeiten müssen zeigen, inwieweit die PMCA andere diagnostische Nachweisverfahren (Mausbioassay, Immunhistochemie) für den BSE-Erreger ergänzen oder gar ersetzen kann. Um die PMCA als ein sicheres Diagnoseverfahren zu verwenden, sind jedoch weitere Untersuchungen insbesondere hinsichtlich der Spezifität der Methode nötig.
  • The protein misfolding cyclic amplification (PMCA) is a method for amplification of the pathological prion protein in vitro and allows the highly sensitive detection of PrPSc molecules. The aim of the present work was to establish this new investigation method for the proof of the BSE agent to characterise different prion strains and analyse tissue samples from the pathogenic study of the FLI (HOFFMANN et al. 2007) for prion concentration. By definition of defaults for the ultrasonic treatments in view of cycle number, sound strength, incubation temperature and cycle duration as well as use of defined negative and positive controls, the PMCA could be adapted successfully. Brain-homogenate of transgenic mice (Tgbov XV) overexpressing bovine PrPC, was used as substrate for conversion. In studies of tissue samples from a total of 4 animals from the pathogenesis study, PrPSc can be detected in the following tissues: the dorsal root ganglion, celiac ganglion, stellate ganglion, trigeminal ganglion, caudal medulla, the jejunal and ileal Peyer's patches, colon, jejunal and ileal mesenteric lymph nodes, the optic nerve, the adrenal glands, the rectum and the spinal cord and the first time in the abomasum, the esophagus and the rumen.The PMCA-technique was also used for the research to the species barrier. Different TSE strains (classical BSE, atypical BSE, classical scrapie, ovine and caprine BSE as well as CWD) were amplified in different substrates with bovine or ovine PrPC. The results showed that the species barrier caused a reduced amplification efficiency in vitro and partially a completely inhibition of the amplification. In addition, it was observed that the amplification efficiency is determined not only by the sequence-homology, but also by the conformation of the used isolates. This correlates with the easier infection of individuals of the same species in contrast to the reduced transferability between foreign species (species barrier). The lacking conversion efficiency is a result of species specific sequence differences in the prion-protein and the resultant structural differences. An evidence to a changed behaviour of the seeds in vivo and in vitro was already described in the literature. Hamster intracerebral infected by a PMCA amplified seed proved that the new formed PrPres was infectious, because the animals developed clinical symptoms similar for scrapie on an average of 165 days after infection (CASTILLA et al. 2005). But hamster inoculated directly by the hamster scrapie strain variation 263K fell already ill after 60 days (KIMBERLIN et al. 1977) what points to a change of the PrPres fragments during the PMCA reaction. A comparable study showed that these results can be reproduced with intracerebral inoculation in mice (WEAVER et al. 2007). Briefly, with PMCA-technique we were able to generate PrPres-amplifications with changed biochemical characteristics. Future works must point, to what extent the PMCA other diagnostic proof procedures (Mouse bioassay, Immunohistochemistry) can complement for the BSE cause or substitute even. To use the PMCA as a sure diagnosis procedure, nevertheless, other investigations are necessary in particular concerning the specificity of the method.

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Metadaten
Author: Martin Franz
URN:urn:nbn:de:gbv:9-001343-2
Title Additional (German):Vermehrung und Analyse des abnormalen Prion-Proteins mit Hilfe der protein misfolding cyclic amplification.
Title Additional (English):Propagation and analysis of the abnormal prion protein using the protein misfolding cyclic amplification
Advisor:Prof. Dr. Jan-Peter Hildebrandt
Document Type:Doctoral Thesis
Language:German
Date of Publication (online):2012/11/26
Granting Institution:Ernst-Moritz-Arndt-Universität, Mathematisch-Naturwissenschaftliche Fakultät (bis 31.05.2018)
Date of final exam:2012/09/12
Release Date:2012/11/26
GND Keyword:BSE, Prion, Prionprotein, Scrapie-Agens, Traberkrankheit
Faculties:Mathematisch-Naturwissenschaftliche Fakultät / Zoologisches Institut und Museum
DDC class:500 Naturwissenschaften und Mathematik / 590 Tiere (Zoologie)