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Untersuchungen zur Regulation und Modifikation des Anionentransporters OATP2B1 (SLCO2B1)

  • Das OATP2B1 stellt neben den überwiegend hepatisch exprimierten OATPs, wie dem OATP1B1 oder OATP1B3 einen weiteren interessanten Vertreter der SLCO-Familie dar. Dieser Aufnahmetransporter ist sowohl aus physiologischer, als auch aus pharmakologischer Sicht interessant, da er eine breite Gewebeverteilung aufweist und neben endogenen Substanzen eine Reihe verschiedener Wirkstoffe transportiert. Hinsichtlich seiner Expression und Funktion ist das OATP2B1 bereits gut charakterisiert, mögliche Regulationsmechanismen hingegen sind bisher kaum untersucht. Es war daher Ziel dieser Arbeit, neue Erkenntnisse über die Regulation dieses Transporters zu erlangen. Eine Möglichkeit die Funktion von Transportproteinen schnell zu verändern, ist die direkte Interaktion mit Substanzen, die in der Lage sind, die Transportfunktion zu modulieren. Dies können gleichzeitig verabreichte Arzneimittel, Nahrungsbestandteile, aber auch endogene Substanzen sein. In der vorliegenden Arbeit konnte hierzu gezeigt werden, dass die Transportfunktion des OATP2B1 durch Progesteron und Glukokortikoide stimuliert werden kann. Dieser Effekt ist sowohl substrat- als auch transporterspezifisch. So wird die Aufnahme sulfatierter Steroide, wie DHEAS oder E1S, OATP2B1-spezifisch stimuliert, wohingegen andere Substrate, wie Atorvastatin oder Glibenclamid nicht verstärkt transportiert werden. Während eine pharmakologische Bedeutung dieser OATP2B1-Interaktion nicht zu erwarten ist, könnte die physiologische Bedeutung in der Aufnahme von Steroidhormonvorläufern in die Plazenta liegen. Diese ist nicht in der Lage C21-Steroide, wie Pregnenolon oder Progesteron in C19-Steroide zu transformieren und daher auf Vorläufermoleküle, wie DHEAS oder Preg-S, für die plazentare Estrogensynthese, angewiesen. Im Rahmen dieser Arbeiten konnten mit Glibenclamid und Preg-S zwei weitere OATP1A2-Substrate identifiziert werden. Des Weiteren wurde der zugrunde liegende Mechanismus der Proteinkinase C (PKC)-abhängigen Internalisierung des OATP2B1 näher untersucht. Es konnte aufgeklärt werden, dass das OATP2B1, nach Aktivierung der PKC, Clathrin-abhängig internalisiert und anschließend lysosomal degradiert wird. Eine direkte Phosphorylierung des OATP2B1 als Ursache für die Internalisierung wurde weitestgehend ausgeschlossen, so dass in der Folge mögliche Internalisierungssignale und Adapterproteine des OATP2B1 untersucht wurden. Mittels in silico Analyse konnte ein Dileucinmotiv (EQQLLV), sowie eine Klasse-I-PDZ-Bindedomäne (DSRV) im Bereich des C-Terminus des Proteins identifiziert werden. Eine Beteiligung an der PKC-abhängigen Internalisierung des OATP2B1 konnte hier zwar nicht beobachtet werden, jedoch zeigte sich, dass es für die basolaterale Sortierung des Proteins von Bedeutung ist. So wies die Dileucinvariante eine ausschließlich apikale Plasmamembran-Lokalisation auf, ohne die Transportfunktion des Proteins zu beeinflussen. Parallel wurden mittels pull-down Experimenten C-terminale Adapterproteine des OATP2B1 identifiziert. In diesem Zusammenhang wurde zudem die Rolle des Dileucinmotivs, als mögliche Bindungsstelle für Adapterproteine, die die basolaterale Sortierung vermitteln, untersucht. Unter denen mittels Massenspektrometrie identifizierten Proteinen befanden sich einige, wie Aktin oder Hsc70, die mit der Clathrin-vermittelten Endozytose assoziiert sind. Weiterhin wurden SNX27, NHERF1 und Grp75 als Adapterproteine identifiziert und näher untersucht. Hier konnte teilweise eine Interaktion bestätigt werden, eine funktionelle Relevanz ließ sich jedoch nicht nachweisen. Insgesamt liefert diese Arbeit wichtige grundlegende Erkenntnisse zur Regulation der OATP2B1-Funktion. Weitere Studien sind jedoch notwendig, um dessen physiologische und pharmakologische Relevanz zu beurteilen.
  • Beside OATP1B1 and OATP1B3 which are predominantly liver specific expressed OATP2B1 represents another interesting member of the SLCO family. This uptake transporter is physiologically as well as pharmacologically relevant because it exhibits a broad tissue distribution and mediates the uptake of endogenous substances and various drugs. With regard to expression and function OATP2B1 is well characterised, whereas little is known about possible regulatory mechanisms. Therefore the aim of this thesis was to gain new insights about the regulation of this transporter. Transporter function may be altered by direct interaction with substances, like concomitantly administered drugs, nutritional components or endogenous substances. In the present work it was shown that transport function of OATP2B1 can be stimulated by progesterone and glucocorticoids. This effect is transporter as well as substrate specific. Uptake of sulphated steroids, like estrone-3-sulphate (E1S) or dehydroepiandrosterone sulphate (DHEAS) by OATP2B1 is stimulated, whereas other substrates like atorvastatin or glibenclamide are not enhanced transported. While a pharmacological meaning of this OATP2B1 interaction is not be expected, a physiological relevance might be an uptake of steroid hormone precursors in the placenta. The placenta is not able to convert C21 steroids, like pregnenolone or progesterone into C19 steroids and depends on precursor molecules like DHEAS or pregnenolone sulphate for synthesis of estrogens. Within the scope of this work, glibenclamide and pregnenolone sulphate could be identified as further substrates of OATP1A2. In addition the underlying mechanism of a protein kinase C (PKC) dependent internalization of OATP2B1 was investigated. It could be resolved that activation of PKC leads to a clathrin-mediated internalization and subsequent lysosomal degradation of OATP2B1. A direct phosphorylation of OATP2B1 as the reason for internalization could be mostly excluded. Consequently, possible internalization signals and adapter proteins of OATP2B1 were examined. By use of in silico analysis a classical dileucin motif (EQQLLV), as well as a class I PDZ binding domain (DSRV) could be identified C-terminal. A contribution to the PKC-dependent internalization of OATP2B1 could not be observed, however it was shown that the dileucin motif is a signal for basolateral sorting of the protein. The dileucin variant was located exclusive in the apical plasma membrane, without affecting transporter function. C-terminal adapter proteins of OATP2B1 were identified by pull down experiments. In this context the role of the dileucin motif as a possible binding site for adapter proteins which mediate the basolateral sorting, was also studied. Among proteins identified via mass spectrometry some were associated with the clathrin-mediated endocytosis, like actin or Hsc70. Furthermore SNX27, NHERF1 und Grp75 were identified as OATP2B1 adapter proteins and investigated in detail. In part an interaction could be confirmed but a functional relevance was not demonstrated. Taken together this thesis provides pivotal findings about regulation of OATP2B1 function. Further studies are necessary to asses its physiological and pharmacological relevance.

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Metadaten
Author: Anna Koenen
URN:urn:nbn:de:gbv:9-001367-8
Title Additional (English):Investigation of regulation and modification of organic anion transporting polypepdtide OATP2B1 (SLCO2B1)
Advisor:Prof. Dr. Heyo K. Kroemer
Document Type:Doctoral Thesis
Language:German
Date of Publication (online):2012/12/20
Granting Institution:Ernst-Moritz-Arndt-Universität, Mathematisch-Naturwissenschaftliche Fakultät (bis 31.05.2018)
Date of final exam:2012/12/03
Release Date:2012/12/20
Tag:OATP2B1, Protein Kinase C, SLC-Familie, Steroidhormone, Transportproteine
OATP2B1, protein kinase C, slc family, steroid hormones, transport proteins
GND Keyword:OATP2B1, Protein Kinase C, SLC-Familie, Steroidhormone, Transportproteine
Faculties:Universitätsmedizin / Institut für Pharmakologie
DDC class:500 Naturwissenschaften und Mathematik / 540 Chemie