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New insights into the regulatory networks of Bacillus subtilis controlling general stress response and osmo adaptation

  • The soil living, Gram-positive bacterium Bacillus subtilis is frequently exposed to a wide variety of stress and starvation conditions in its natural environment. In order to survive under these environmental and energy stresses, the bacterium acquired a general stress response mechanism mediated by the alternative sigma factor, SigB. A wide-variety of stress conditions such as environmental stress conditions like ethanol stress, heat stress, oxidative stress, osmotic stress or limitation of glucose, oxygen, phosphate etc.; and low temperature growth induce this SigB-dependent general stress response. Though much is known about the mechanisms of activation of this general stress response, the conditions that induce the SigB regulon and its general functions, the definition of the structure of the SigB regulon is not completely clear. The SigB-dependent general stress regulon has previously been characterized by proteomic approaches as well as DNA-array based expression studies. Genome-wide expression studies performed by Price, Petersohn and Helmann defined the SigB regulon containing well above 100 target genes, however the overlapping list of target genes contains only 67 members. The differences between these studies probably result from the different strains, growth conditions, array platforms and experimental setups used in these studies. The first part of this work presents a targeted microarray analysis, which was performed to gain a better understanding of the structure of the general stress regulon. This is the first study analyzing the gene expression of a wild type strain and its isogenic sigB mutant strain for almost all known SigB inducing conditions, using the same array platform. Furthermore, the kinetics of the gene expression of 252 putative SigB-dependent genes and 36 appropriate control genes were recorded. The data were analyzed using Random Forest, a machine-learning algorithm, by incorporating the knowledge of previous studies. Two Random Forest models were designed in this study. The “expression RF” model was designed to identify genes showing expression differences between wild type and sigB mutant and the “kinetic RF” model to identify genes having a SigB-dependent expression kinetic, but is subject to secondary regulators next to SigB influencing their expression in the sigB mutant. The random forest classification using the “expression RF” model identified 166 genes as SigB regulon members based on the expression differences between the wild type and the sigB mutant strain. A variable importance plot showing the impact during the classification process within the “expression RF” could assign a hierarchy to the stress conditions investigated in this study. This hierarchy suggested all the RsbU-dependent environmental stresses to have higher impact on SigB-dependent gene expression compared to the RsbP-dependent energy stresses. The “kinetic RF” model identified 30 additional genes, having additional regulators next to SigB. The SigB dependency of the 30 genes identified by the “kinetic RF” model was validated by screening for SigB promoter motifs within the upstream region of these genes. The hierarchical clustering of the obtained motifs scores with the expression ratios of the SigB regulon members predicted in the current work revealed that only a subset of genes displayed correlation of gene expression values and sequence motifs. As this observation is not true for all sets of genes, it cannot be generalized that gene expression is only correlated with the corresponding motif scores. In total 196 SigB regulon members could be classified by this targeted oligo nucleotide microarray study. The majority of these regulon members were preceded by a putative SigB promoter motif either identified previously or predicted in the current work. The inclusion of the broad range of stress conditions, from environmental stresses to energy limiting conditions enabled a more detailed characterization of the structure of the general stress regulon of B. subtilis. The implementation of machine learning algorithms allowed the prediction with a minimum number of false-positives. In the second part of this work a high resolution tiling array analysis for the majority of growth conditions, stresses and changes in carbon sources supply was exploited for the screening for new SigB targets within already annotated or newly annotated RNA features. Thereby 133 previously un-annotated RNA features, which were completely new, were assigned to the SigB regulon. 50 of these 133 new features encode antisense RNAs which can have potential influence on the transcription / translation of their sense RNAs targets. A set of 282 annotated genes were indentified to be SigB regulon members, comparison with the targeted oligo nucleotide study, 90 genes were newly identified and not known to be SigB-dependent before. The analysis of the expression levels of these genes by k-means clustering revealed a cluster of 32 genes having low induction levels in all SigB-inducing conditions, although the majority of these genes possess a well-conserved SigB promoter motif. However, all these genes are probably subject to the control of regulators other than SigB, which might mask the typical strong SigB-dependent induction in the analyzed stress conditions. The analysis of the expression levels of the SigB regulon under a variety of conditions, revealed the SigB-dependent expression in conditions such as growth on plates, in swarming cells, biofilm formation and growth on glycerol as a carbon source. The possible reason for the induction of the SigB regulon during growth on plates and in swarming cells was supposed to be due to scarcity of the nutrients on plates, e.g. glucose limitation. SigB-dependent genes were likely induced during growth on glycerol due to the oxygen limitation that arose during the growth. However, induction of the SigB regulon during biofilm formation is assumed to be due to the phosphate limitation. The description of these new SigB activating stimuli gains support from the fact that the majority of the SigB-dependent genes were induced under these growth conditions. In addition to the general stress response, B. subtilis cells have stress specific adaptive mechanisms such as osmotic response, which was addressed in the third part of this dissertation. The frequent flooding and drying of the soil triggered osmotic stress, one of the most common stress conditions encountered by soil bacteria. Bacterial cells are equipped with osmo-specific adaptation responses in which specific regulation of a set of genes is used to maintain proper cellular function. It was known from previous studies that a large set of genes were influenced in expression by salt shock as well as growth at high osmolarity. Detailed analysis of the tiling array data revealed 467 differentially regulated newly annotated features during salt shock and 251 newly annotated features that were expressed at a different level during continuous growth at high versus low osmolarity. A comparison of the studies that used the sigB knockout mutant with the tiling array study also provided support for the sigma factor competition in control of the expression of osmo-adaptive genes. The level of induction of specific osmo-adaptive genes was much higher in the sigB mutant strain compared to the wild type strain. Furthermore, the tiling array data revealed a SigB-dependent antisense RNA S1290 upstream of the opuB operon that transports choline to the cell. The presence of this antisense RNA had a potential impact on the transcription of the opuB operon, during salt shock. In agreement with the previous studies, the tiling array data assigned the osmotically regulated proHJ operon to the SigE regulon, with a SigE promoter upstream. In addition, the significantly higher percentage of proline among spore coat proteins also supports the assumption that osmotic synthesis of proline might play a role during the generation of spores. In conclusion, the tiling array data revealed newly annotated RNA features that are regulated during the general stress response as well as the osmotic response of the cell. The current work identifies new conditions that induce the majority of SigB-dependent genes as well as the new features that regulate the osmotically induced genes.
  • Das Gram-positive Boden-Bakterium Bacillus subtilis ist in seiner natürlichen Umgebung einer Vielzahl von wechselnden Stress und Hungerbedingungen ausgesetzt. Um unter diesen Umweltbedingungen überleben zu können, verfügt das Bakterium über den Mechanismus der generellen Stressantwort, welche durch den alternativen Sigma-Faktor SigB vermittelt wird. Eine Vielzahl an Streßbedingungen, wie die Umweltstresse durch Ethanol, Hitze, oxidativer Stress und osmotischer Stress oder die Limitation von Glucose, Sauerstoff oder Phosphat und das Wachstum bei niedriger Temperatur induzieren die SigB-abhängige allgemeine Stressantwort. Obwohl viel über die Mechanismen der Aktivierung, die induzierenden Bedingungen, die Zusammensetzung des SigB Regulons und dessen allgemeinen Funktionen bekannt ist, ist die Struktur des SigB Regulons noch nicht völlig aufgeklärt. Bei der bisherigen Suche nach Mitgliedern des SigB Regulons wurden sowohl Proteom-Ansätze als auch DNA-Array-basierte Expressionsstudien eingesetzt. Genomweite Expressionsstudien der Arbeitsgruppen Price, Petersohn und Helmann ordneten jeweils mehr als 100 Gene dem SigB Regulon zu. Jedoch war die Überlappung zwischen den Studien mit 67 Genen relativ gering. Diese Unterschiede sind vermutlich auf die verschiedenen Stämme, Wachstumsbedingungen, Array Plattformen und Versuchsaufbauten der drei Studien zurückzuführen. Der erste Teil dieser Arbeit präsentiert eine gezielte Microarray Analyse, welche durchgeführt wurde um ein besseres Verständnis der Struktur des allgemeinen Stress Regulons zu gewinnen war. Diese Untersuchung ist die erste Analyse der Genexpression eines Wildtyp-Stammes und seiner isogenen SigB Mutante, welche fast alle bekannten SigB induzierenden Bedingungen berücksichtigt und auf der gleichen Array Plattform durchgeführt wurde. Sie beinhaltet darüber hinaus eine Kinetik der Genexpression von 252 putativen SigB-abhängigen Genen und 36 entsprechende Kontroll-Genen. Die Daten wurden mit Hilfe eines Maschine-Learning-Algorithmus, dem Random Forest (RF) Algorithmus, welcher die Integration der Ergebnisse der vorherigen Studien erlaubt, analysiert. Hierzu wurden zwei Random Forest Modelle in dieser Studie konzipiert und angewandt. Das erste "Expression RF" Modell wurde entwickelt, um Gene mit Expressionsunterschieden zwischen dem Wildtyp und der SigB Mutante zu identifizieren. Das zweite "kinetic RF" Modell wurde genutzt, um Gene zu identifizieren, welche zwar eine SigB-abhängige Expressionskinetik aufweisen, aber bei denen ein sekundärer Regulator die Expression in der SigB-Mutante beeinflusst. Insgesamt konnten mit Hilfe der gezielten Microarray Studie 196 SigB Regulon Mitglieder klassifiziert werden. Die Mehrheit dieser Regulon Mitglieder besitzt einen in dieser Studie oder zuvor vorhergesagten SigB Promotor. Die Einbeziehung einer breiten Palette von Stress-Bedingungen, von Umweltstress und Energie Limitationen ermöglichte eine genauere Charakterisierung der Struktur des SigB Regulons in B. subtilis. Die Verwendung des Random Forest Maschine-Learning-Algorithmus erlaubte die Vorhersage mit einer minimalen Anzahl von falsch-positiven Ergebnissen. Im zweiten Teil dieser Arbeit wurde die Daten einer hoch auflösenden Tiling Array Analyse genutzt. In diesen Daten, welche die Mehrheit aller für B. subtilis bekannten Wachstumsbedingungen, Stresse und Veränderungen der Kohlenstoff-Quellen berücksichtigt, konnten neue SigB-abhängig exprimierte DNA Sequenzen sowohl unter den bereits annotierten Transkripten, als auch unter den bis dahin unbekannten Transkripten identifiziert werden. Hierbei konnten 133 bisher unbekannte Transkripte dem SigB Regulon zugeordnet werden. Unter diesen 133 neuen Transkripten befinden sich 50 Antisense-RNAs, welche besonders interessant sind, da sie möglicherweise die Transkription / Translation der jeweiligen Sense RNAs beeinflussen. Der Vergleich der Gruppe von 282 bereits annotierten Genen, welche dem SigB Regulon zugeordnet werden konnten, mit den Genen, welche in der gezielten Microarray Studie dem SigB Regulon zugeordnet wurden, ergab eine Gruppe von 90 Genen. Die Analyse der Expression dieser 90 neu identifizierten Gene mit Hilfe eines k-means Clustering offenbarte ein Cluster mit 32 Genen, welche eine geringe Induktion in allen klassischen SigB-induzierenden Bedingungen aufwiesen, jedoch ein gut konserviertes SigB Promotor Motiv besitzen. Möglicherweise verdeckt hier eine sekundäre Regulation die SigB-abhängige Induktion in den analysierten Stress-Bedingungen. Die Inspektion aller in der Tiling Array Analyse verwendeten Bedingungen bezüglich der Expression des SigB Regulons offenbarte neue Bedingungen mit SigB-anhängiger Expression. So konnten beispielsweise das Wachstum auf Agar-Platten, das Wachstum in Biofilmen und das Wachstum mit Glycerin als Kohlenstoffquelle als Bedingungen identifiziert werden, unter welchen es zu einer SigB-abhängigen Expression kommt. Eine weitere Suche nach möglichen Gründen für die Induktion des SigB Regulons unter diesen Bedingungen ergab, dass beim Wachstum auf Platten eine SigB induzierende Nährstofflimitation (Glukose) auftritt, dass die Induktion des SigB Regulons beim Wachstum auf Glycerin möglicherweise aufgrund einer Sauerstoff-Limitation eintritt und dass während der Biofilmbildung Phosphat-Hunger die SigB-Induktion auslöst. Diese Entdeckung neuer SigB induzierender Bedingungen wird dadurch gestärkt, dass neben den jeweiligen spezifischen Stressantworten auch die Mehrheit der SigB-abhängigen Gene unter den genannte Wachstumsbedingungen induziert wurde. Neben der allgemeinen Stressantwort besitzt B. subtilis auch eine Reihe von Stress spezifischen Adaptations-Mechanismen. Einer dieser Mechanismen, die Reaktion auf osmotischen Stress, wird im dritten Teil der Arbeit behandelt. Der durch Flutung und Trocknen des Bodens ausgelöste osmotische Stress ist einer der häufigsten Stresse denen B. subtilis als Bodenbakterien ausgesetzt ist. Hierfür besitzt die Zelle eine Gruppe von osmotisch induzierten Genen, deren Genprodukte eine Reihe von osmo-spezifischen Anpassungsreaktionen initiieren, welche die korrekte Funktion der Zelle gewährleisten. Eine detaillierte Analyse der Tiling Array-Daten bezüglich der osmotisch bedingten Regulation ergab 467 bis dahin unbekannte Transkripte und 251 annotierte Transkripte, deren Expression bei kontinuierlichem Wachstum unter hoher Osmolarität verglichen zur Kontrolle bei niedriger Osmolarität verändert war. Weiterhin konnte eine SigB-abhängige Antisene RNA S1290 identifiziert werden, welche die Expression des opuB Operons unter Salz-Schock Bedingungen regulieren könnte. Zusammenfassend konnten mit Hilfe der Tiling Array Analyse neue Transkripte der generellen Stressantwort und der osmotischen Stressantwort in B. subtilis zugeordnet werden. Es konnten neue Bedingungen identifiziert werden, in denen ein Großteil der SigB-abhängigen Gene induziert wird. bisherigen Suche nach Mitgliedern des SigB Regulons wurden sowohl Proteom-Ansätze als auch DNA-Array-basierte Expressionsstudien eingesetzt. Genomweite Expressionsstudien der Arbeitsgruppen Price, Petersohn und Helmann ordneten jeweils mehr als 100 Gene dem SigB Regulon zu. Jedoch war die Überlappung zwischen den Studien mit 67 Genen relativ gering. Diese Unterschiede sind vermutlich auf die verschiedenen Stämme, Wachstumsbedingungen, Array Plattformen und Versuchsaufbauten der drei Studien zurückzuführen. Der erste Teil dieser Arbeit präsentiert eine gezielte Microarray Analyse, welche durchgeführt wurde um ein besseres Verständnis der Struktur des allgemeinen Stress Regulons zu gewinnen war. Diese Untersuchung ist die erste Analyse der Genexpression eines Wildtyp-Stammes und seiner isogenen SigB Mutante, welche fast alle bekannten SigB induzierenden Bedingungen berücksichtigt und auf der gleichen Array Plattform durchgeführt wurde. Sie beinhaltet darüber hinaus eine Kinetik der Genexpression von 252 putativen SigB-abhängigen Genen und 36 entsprechende Kontroll-Genen. Die Daten wurden mit Hilfe eines Maschine-Learning-Algorithmus, dem Random Forest (RF) Algorithmus, welcher die Integration der Ergebnisse der vorherigen Studien erlaubt, analysiert. Hierzu wurden zwei Random Forest Modelle in dieser Studie konzipiert und angewandt. Das erste "Expression RF" Modell wurde entwickelt, um Gene mit Expressionsunterschieden zwischen dem Wildtyp und der SigB Mutante zu identifizieren. Das zweite "kinetic RF" Modell wurde genutzt, um Gene zu identifizieren, welche zwar eine SigB-abhängige Expressionskinetik aufweisen, aber bei denen ein sekundärer Regulator die Expression in der SigB-Mutante beeinflusst. Insgesamt konnten mit Hilfe der gezielten Microarray Studie 196 SigB Regulon Mitglieder klassifiziert werden. Die Mehrheit dieser Regulon Mitglieder besitzt einen in dieser Studie oder zuvor vorhergesagten SigB Promotor. Die Einbeziehung einer breiten Palette von Stress-Bedingungen, von Umweltstress und Energie Limitationen ermöglichte eine genauere Charakterisierung der Struktur des SigB Regulons in <i>B. subtilis</i>. Die Verwendung des Random Forest Maschine-Learning-Algorithmus erlaubte die Vorhersage mit einer minimalen Anzahl von falsch-positiven Ergebnissen. Im zweiten Teil dieser Arbeit wurde die Daten einer hoch auflösenden Tiling Array Analyse genutzt. In diesen Daten, welche die Mehrheit aller für <i>B. subtilis</i> bekannten Wachstumsbedingungen, Stresse und Veränderungen der Kohlenstoff-Quellen berücksichtigt, konnten neue SigB-abhängig exprimierte DNA Sequenzen sowohl unter den bereits annotierten Transkripten, als auch unter den bis dahin unbekannten Transkripten identifiziert werden. Hierbei konnten 133 bisher unbekannte Transkripte dem SigB Regulon zugeordnet werden. Unter diesen 133 neuen Transkripten befinden sich 50 Antisense-RNAs, welche besonders interessant sind, da sie möglicherweise die Transkription / Translation der jeweiligen Sense RNAs beeinflussen. Der Vergleich der Gruppe von 282 bereits annotierten Genen, welche dem SigB Regulon zugeordnet werden konnten, mit den Genen, welche in der gezielten Microarray Studie dem SigB Regulon zugeordnet wurden, ergab eine Gruppe von 90 Genen. Die Analyse der Expression dieser 90 neu identifizierten Gene mit Hilfe eines k-means Clustering offenbarte ein Cluster mit 32 Genen, welche eine geringe Induktion in allen klassischen SigB-induzierenden Bedingungen aufwiesen, jedoch ein gut konserviertes SigB Promotor Motiv besitzen. Möglicherweise verdeckt hier eine sekundäre Regulation die SigB-abhängige Induktion in den analysierten Stress-Bedingungen. Die Inspektion aller in der Tiling Array Analyse verwendeten Bedingungen bezüglich der Expression des SigB Regulons offenbarte neue Bedingungen mit SigB-anhängiger Expression. So konnten beispielsweise das Wachstum auf Agar-Platten, das Wachstum in Biofilmen und das Wachstum mit Glycerin als Kohlenstoffquelle als Bedingungen identifiziert werden, unter welchen es zu einer SigB-abhängigen Expression kommt. Eine weitere Suche nach möglichen Gründen für die Induktion des SigB Regulons unter diesen Bedingungen ergab, dass beim Wachstum auf Platten eine SigB induzierende Nährstofflimitation (Glukose) auftritt, dass die Induktion des SigB Regulons beim Wachstum auf Glycerin möglicherweise aufgrund einer Sauerstoff-Limitation eintritt und dass während der Biofilmbildung Phosphat-Hunger die SigB-Induktion auslöst. Diese Entdeckung neuer SigB induzierender Bedingungen wird dadurch gestärkt, dass neben den jeweiligen spezifischen Stressantworten auch die Mehrheit der SigB-abhängigen Gene unter den genannte Wachstumsbedingungen induziert wurde. Neben der allgemeinen Stressantwort besitzt <i>B. subtilis</i> auch eine Reihe von Stress spezifischen Adaptations-Mechanismen. Einer dieser Mechanismen, die Reaktion auf osmotischen Stress, wird im dritten Teil der Arbeit behandelt. Der durch Flutung und Trocknen des Bodens ausgelöste osmotische Stress ist einer der häufigsten Stresse denen <i>B. subtilis</i> als Bodenbakterien ausgesetzt ist. Hierfür besitzt die Zelle eine Gruppe von osmotisch induzierten Genen, deren Genprodukte eine Reihe von osmo-spezifischen Anpassungsreaktionen initiieren, welche die korrekte Funktion der Zelle gewährleisten. Eine detaillierte Analyse der Tiling Array-Daten bezüglich der osmotisch bedingten Regulation ergab 467 bis dahin unbekannte Transkripte und 251 annotierte Transkripte, deren Expression bei kontinuierlichem Wachstum unter hoher Osmolarität verglichen zur Kontrolle bei niedriger Osmolarität verändert war. Weiterhin konnte eine SigB-abhängige Antisene RNA S1290 identifiziert werden, welche die Expression des opuB Operons unter Salz-Schock Bedingungen regulieren könnte. Zusammenfassend konnten mit Hilfe der Tiling Array Analyse neue Transkripte der generellen Stressantwort und der osmotischen Stressantwort in <i>B. subtilis</i> zugeordnet werden. Es konnten neue Bedingungen identifiziert werden, in denen ein Großteil der SigB-abhängigen Gene induziert wird.

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Metadaten
Author: Priyanka Nannapaneni
URN:urn:nbn:de:gbv:9-001379-1
Title Additional (German):Neue Einblicke in die regulatorischen Netzwerke zur Steuerung der allgemeinen Stressantwort und der osmotischen Anpassung in Bacillus subtilis
Advisor:Prof. Dr. Jörg Stülke, Prof. Dr. Uwe Völker
Document Type:Doctoral Thesis
Language:English
Date of Publication (online):2013/01/09
Granting Institution:Ernst-Moritz-Arndt-Universität, Mathematisch-Naturwissenschaftliche Fakultät (bis 31.05.2018)
Date of final exam:2013/01/07
Release Date:2013/01/09
Tag:General stress response, SigB, expression analysis, osmotic stress, tiling array
GND Keyword:Heubacillus, Microarray
Faculties:Universitätsmedizin / Arbeitsgruppe "Funktionelle Genomforschung"
DDC class:500 Naturwissenschaften und Mathematik / 570 Biowissenschaften; Biologie