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Protein-Engineering von Enzymen mit Alpha/Beta Hydrolasefaltung

  • Alpha/Beta-Hydrolasefaltungsenzyme wie Esterasen, Dehalogenasen oder Epoxidhydrolasen sind Enzyme, die unter anderem zur Detoxifizierung von Umweltschadstoffen und der Synthese von Feinchemikalien eingesetzt werden. In dieser Arbeit wurden die Alpha/Beta-Hydrolasefaltungsenzyme untersucht. Im ersten Teil der Arbeit wurde eine Dehalogenaseaktivität in der Esterase PFE I und der Epoxidhydrolase EchA erzeugt. Dabei wurden die katalytischen Loops und die Cap-Domäne ausgetauscht, sowie ein rationales Design durchgeführt. Mit dem Computerprogramm 3DM wurde des Weiteren die Konsensussequenz von Haloalkandehalogenasen ermittelt und diese in die Esterase PFE I integriert. Zur Untersuchung der geringen promiskuitiven Aktivitäten wurden sensitive Aktivitätsassays mit isothermaler Titrationskalorimetrie entwickelt. Im zweiten Teil dieser Arbeit wurden zwei kontinuierlich gerichtete Evolutionen durchgeführt. Die benötigten in vivo Mutagenesemethoden und Selektionsassays wurden in dieser Arbeit etabliert. Im Anschluss wurden die Methoden eingesetzt um zum Ersten die Enantioselektivität von Esterasen zu verbessern und zum Zweiten eine Dehalogenaseaktivität in Esterasen und Epoxidhydrolasen zu generieren.
  • Alpha/Beta-Hydrolase fold enzymes like esterases, dehalogenases or epoxide hydrolases are important for the detoxification of environmental pollutants or the synthesis of fine chemicals. In this work the Alpha/Beta-Hydrolase fold enzymes were investigated. In the first part an esterase respectively an expoxide hydrolase was turned to a dehalogenase. With the exchange of the catalytic loops, domains, rational designed enzymes or enzymes constructed in correlation with consensus sequence approaches, dehalogenase activity was obtained. In addition sensitive analytics were established to prove the small activity. In the second part, two continuously directed evolutions were executed. In vivo mutagenesis strategies as well as selectivity assays were established to make a continuous directed evolution to improve the enantioselectivity of esterases and to create a dehalogenase activity in epoxide hydrolases.

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Metadaten
Author: Timo Davids
URN:urn:nbn:de:gbv:9-001424-2
Title Additional (English):Protein Engineering of Alpha/Beta hydrolase fold enzymes
Advisor:Prof. Dr. Uwe Bornscheuer
Document Type:Doctoral Thesis
Language:German
Date of Publication (online):2013/03/14
Granting Institution:Ernst-Moritz-Arndt-Universität, Mathematisch-Naturwissenschaftliche Fakultät (bis 31.05.2018)
Date of final exam:2013/01/23
Release Date:2013/03/14
Tag:Kontinuierliche gerichtete Evolution, Selektionsassay
selection assay
GND Keyword:Hydrolasen, Mutagenese, Promiskuität, Proteindesign
Faculties:Mathematisch-Naturwissenschaftliche Fakultät / Institut für Chemie und Biochemie
DDC class:500 Naturwissenschaften und Mathematik / 540 Chemie