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Functional and Molecular Investigations of the Disease Resistance in Rainbow Trout Using the Peritoneal Model of Inflammation

  • Rainbow trout (Oncorhynchus mykiss) represents the third most produced species of diadromous fish, with the total production of 0,732 million tonnes in 2009. More than one third of this production comes from Europe, where it is dominated by Norway, Italy and France. Germany is the fifth biggest producer in Europe, producing 21 thousand tonnes of rainbow trout in the value of 6,1 million Euro. However, the conditions in the intensive aquaculture often increase the disease susceptibility to many pathogens. One of the highest economic threats for a salmonids aquaculture is the causative agent of furunculosis, Aeromonas salmonicida subsp. salmonicida. Several strategies have been developed to protect the fish, but the traditional methods are either laborious or represent a potential risk for the environment. The selective breeding established more than 35 years ago in the brackish waters of Baltic Sea represent a attractive alternative, delivering a novel strain of rainbow trout better adapted to the brackish environment and exhibiting reduced mortality in the infection with A.salmonicida. Nevertheless, no information was available about the fundaments of this phenomenon. Thus, the aim of presented study was the identification of immune adaptations, which occurred during the 30 years of selection and favoured increased survival of “born” trout to the bacterial diseas es. In the presented work, the peritoneal cavity of rainbow trout has been used as a model for the investigation of disease resistance in fish. In the first chapter, the peritoneal cavity has been described as a unique niche of teleost immune system and the kinetic of peritoneal leukocytes induced by the stimulation has been analysed. Furthermore, a unique set of monoclonal antibodies has been used to evaluate the contribution of distinct cell populations on the inflammation and its resolution. In the second part of the study, the transcriptional changes of peritoneal leukocytes have been evaluated using the GRASP microarray. The following analysis provided unique insights into the local immune response in rainbow trout. The unprecedented combination of both data sets offers an unparalleled description of the local immune response in teleost fish and can be summarized into following facts. In general, the obtained results revealed, that the unstimulated peritoneal cavity is populated predominantly by lymphocytes with IgM+ Bcells being the major cells type. The rapid changes in the composition induced by the stimulation were underlined by the upregulation of major proinflammatory molecules such as IL1β, IL8 and TNFα within 12hpi. Although the initial phase of the reaction was dominated by myeloid cells, the cavity underwent within 72 hours two complete changes in the composition corresponding with the massive changes in the transcriptome. Eventually, the resolution of inflammation was marked by an increasing number of lymphocytes and correlated with the downregulation of pro-inflammatory genes to the initial level and upregulation of anti-inflammatory cytokines IL10 and TGFβ. Besides the general observations common to all treatments and both strains, our experiments revealed also remarkable differences between the antigenic stimulation and reaction towards pathogen. From these differences following conclusions can be drawn; the infection induces comparable reaction pattern as the stimulation, although the intensity of the reaction and number of cells is higher. These observations correlated with the higher expression of inflammatory molecules after the infection. Viable bacteria also prolong the myeloid phase of the reaction and delay the resolution of inflammation. Finally, model of peritoneal inflammation caused by A. salmonicida has been applied also to the second strain of rainbow trout, known for its higher resistance to infection. The comparison of obtained data suggested that resistant trout reacted to the antigenic stimulation and infection with a lower number of cells despite minor differences in the expression level of major pro-inflammatory molecules during early stages of the infection. Eventually, the resolution of inflammation and onset of adaptive immune response occurred in resistant trout almost 24 hours earlier and was correlating with an increased expression of anti-inflammatory cytokines IL10 and TGFβ. Notably, the increased survival of resistant strain correlates with the increased expression of antibacterial proteins such as NRAMP and hepcidin. Taken together, obtained data provided unprecedented insights into the local immune response in teleost fish and identified features conserved during the selection breeding in the brackish water of Baltic Sea. Additionally, combination of cellular and molecular data elucidates the peritoneal inflammation in fish and suggested high conservation of the immune response in the evolution.
  • Die Regenbogenforelle (Oncorhynchus mykiss) ist unter den Salmoniden die am dritthäufigsten in Aquakultur produzierte Art mit einer Gesamtproduktion mehr als 700000t weltweit pro Jahr. Mehr als ein Drittel davon wird in Aquakulturanlagen in Europa produziert. Deutschland ist der fünftgrößte Produzent. Mit der steigenden Nachfrage und damit steigenden Mengen an Fisch aus Aquakultur werden auch die Probleme in der intensiven Aquakultur deutlicher. Insbesondere die erhöhte Anfälligkeit der in hoher Dichte gehaltenen Fische für Krankheitserreger bereitet Sorgen. Für die Aquakultur von Salmoniden ist die Furunkulose hervorgerufen durch das gramnegative Bakterium, Aeromonas salmonicida subsp. Salmonicida von hoher Bedeutung. Zwei Behandlungsstrategien gegen Furunkulose wurde entwickelt: Impfung oder Antibiotikabehandlung. Allerdings sind diese Methoden entweder sehr arbeitsaufwendig oder umweltschädlich. Die selektive Zucht von Regenbogenforellen, die vor mehr als 35 Jahren im Brackwasser der Ostsee etabliert wurde, stellt eine attraktive Alternative dar. Ziel des Züchtungsprogramms war eine an die Bedingungen im Brackwasser angepasst Regenbogenforelle, die eine erhöhte Resistenz gegen bakterielle Infektionen insbesondere gegen Vibrio sp. und A. salmonicida aufweist. Dies wurde mit der regionalen Inzuchtlinie „Born“ auch erreicht, allerdings sind bis heute die Ursachen für die beobachtete Anpassung an den Lebensraum Brackwasser nicht aufgeklärt. Das Ziel der vorliegenden Arbeit ist die Charakterisierung der immunologischen Adaptation, die zu der erhöhten Resistenz gegen bakterielle Pathogene der Forellenlinie „Born“ im Vergleich mit der kommerziellen, auf Massezuwachs selektierten Importzuchtlinie „Steelhead“ führt In der vorliegenden Arbeit wurde die Peritonealhöhle der Regenbogenforelle als Modell für diese Untersuchungen genutzt. Im ersten Kapitel wurde die Peritonealhöhle als ein besonderes Kompartiment des Immunsystems von Knochenfischen beschreibend analysiert und die Kinetik von peritonealen Leukozyten nach induzierter Stimulation untersucht. Es wurde ein Set von monoklonalen Antikörpern spezifisch für Marker auf Leukozytenpopulationen genutzt, um die Beteiligung der verschiedenen Leukozyten an der Entstehung und Beendigung einer E ntzündugsreaktion zu untersuchen. Im zweiten Teil der Studie wurde unter Verwendung von GRASP Mikroarrays die transkriptionelle Genregulation von peritonealen Leukozyten untersucht. Diese erstmalig verwendete Kombination beider Methoden ermöglichte so bisher nicht dokumentierte Einblicke in die lokale Immunantwort im Peritoneum von Regenbogenforelle: 1. Die unstimulierte Peritonealhöhle ist hauptsächlich von IgM+ B- Lymphozyten besiedelt. 2. Durch antigene Stimulation verändert sich innerhalb von 72h nach Stimulation die Zusammensetzung der Peritonealleukozyten komplett: Zuerst dominierten B-Zellen, danach überwiegen Entzündungszellen (Monozyten, Makrophagen und Granulozyten) und 72h nach Antigeninjektion proliferieren B-Lymphozyten massiv. 3. Damit in Zusammenhang steht eine Hochregulierung wichtiger proinflammatorischer Moleküle wie IL1β, IL8 und TNFα innerhalb von 12 Stunden p.i. 4. Die letztendliche Auflösung der Inflammation war gekennzeichnet durch eine starke Proliferation von Lymphozyten die mit einer Herabregulation von pro-inflammatorischen Genen und einer Hochregulation der anti-inflammatorischen Zytokine IL10 und TGFβ korrelierte. Diese Leukozytenkinetik war sowohl bei antigener Stimulation als auch bei intraperitonealer Infektion grundsätzlich gleich. Dennoch zeigten sich deutliche Unterschiede: a) Eine intraperitonealer Infektion mit A. salmonicida induziert deutlich stärkere zelluläre Reaktionen. b) Diese korrelierten mit einer höheren Expression von pro-inflammatorischen Molekülen nach der Infektion. c) Lebenden Bakterien verlängern die initiale myeloide Phase und verzögern die Auflösung der Entzündung im Vergleich zu inaktivierten Bakterien. Schließlich wurde das hier etablierte Modell der intraperitonealen Stimulation, mit A. salmonicida, für vergleichende Untersuchungen der beiden unterschiedlich selektierten Linien der Regenbogenforelle, angewandt. Der erhaltenen Daten legt zeigt interessante Unterschiede in der zellulären Kinetik und in der transkriptionellen Regulation zwischen beiden Forellenlinien führten die erhaltenen Daten zu neuen Einblicken in die lokale Immunantwort von Knochenfischen und identifizierten Merkmale, die sich während der selektiven Zucht im Brackwasser der Ostsee herausbildet hatten. Außerdem die Kombination von zellulären und molekularen Daten die peritoneale Inflammation bei Fischen und deutet auf eine hohe Konservierung der Immunantwort in der Evolution hin.

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Metadaten
Author: Tomas Korytar
URN:urn:nbn:de:gbv:9-001456-4
Title Additional (German):Funktionelle und molekulare Untersuchungen zur Resistenz gegen Infektionserreger in frühen Vertebraten am Modell der bakteriellen Peritonitis der Regenbogenforelle
Advisor:Prof. Dr. Dr. h.c. Thomas C. Mettenleiter
Document Type:Doctoral Thesis
Language:English
Date of Publication (online):2013/04/11
Granting Institution:Ernst-Moritz-Arndt-Universität, Mathematisch-Naturwissenschaftliche Fakultät (bis 31.05.2018)
Date of final exam:2013/02/19
Release Date:2013/04/11
Tag:Aeromonas salmonicida, Flow Cytometry, Peritonitis, Rainbow trout, Selective breeding
GND Keyword:Aeromonas salmonicida, Bakterielle Infektion, Bauchfellentzündung, Cytometrie, Entzündung, Monoklonaler Antikörper, Regenbogenforelle
Faculties:Mathematisch-Naturwissenschaftliche Fakultät / Abteilung für Mikrobiologie und Molekularbiologie
DDC class:500 Naturwissenschaften und Mathematik / 570 Biowissenschaften; Biologie