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Regulatory mechanisms of the disulfide stress response and the role of the bacillithiol redox buffer in Gram-positive bacteria

  • Reactive oxygen species (ROS) can damage all cellular macromolecules and also produce secondary reactive intermediates, like reactive electrophilic species (RES) that include quinones or aldehydes. Low molecular weight (LMW) thiols are small thiol-containing compounds that play essential roles in the defense against ROS and RES in all organisms. The best studied LMW thiol is the tripeptide glutathione (GSH). Firmicutes bacteria including Bacillus und Staphylococcus species have been recently discovered to utilize the redox buffer bacillithiol (BSH). LMW thiols function as redox buffers to maintain the reduced state of the cytoplasm. Under conditions of oxidative stress, LMW thiols also react with protein thiols to form mixed LMW thiol – protein disulfides, termed S-thiolations, as major protection mechanism. Investigating the role of BSH in oxidative stress response and ROS-induced S-thiolations in Firmicutes bacteria was one subject of this PhD thesis. Specifically, the regulatory mechanisms and post-translational thiol-modifications in response to NaOCl stress were studied in the model bacterium for low-GC Gram-positive bacteria Bacillus subtilis. The transcriptome profile after NaOCl stress was indicative of disulfide stress and overlapped strongly with the response to diamide. NaOCl stress caused induction of the thiol- and oxidative stress-specific Spx, CtsR, PerR and OhrR regulons. Thiol redox proteomics identified only few NaOCl-sensitive proteins with reversible thiol-oxidations. Using mass spectrometry, eleven proteins were identified that were oxidized to mixed BSH protein disulfides (S-bacillithiolated) in B. subtilis cells after NaOCl-exposure. Methionine synthase MetE is the most abundant S-bacillithiolated protein in B. subtilis and other Bacillus species after NaOCl exposure. S-bacillithiolation of OhrR repressor leads to upregulation of the OhrA peroxiredoxin that confers together with BSH specific protection against NaOCl. S-bacillithiolation of MetE, YxjG, PpaC, and SerA causes hypochlorite-induced methionine starvation as supported by the induction of the S-box regulon. To further assess the conservation of targets for S-bacillithiolations in other Firmicutes bacteria, we studied the S-bacillithiolomes of Bacillus megaterium, Bacillus pumilus, Bacillus amyloliquefaciens, and Staphylococcus carnosus under NaOCl stress conditions. In total, 54 S-bacillithiolated proteins were identified, including 29 unique proteins and 8 conserved proteins involved in amino acid and cofactor biosynthesis, nucleotide metabolism, translation, protein quality control, redox and antioxidant functions. Together our data support a major role of BSH redox buffer in redox control and thiol protection of conserved and essential proteins against irreversible oxidation by S-bacillithiolations in Firmicutes bacteria. In response to ROS and RES, bacteria also activate the expression of antioxidant and detoxification enzymes, such as catalases, peroxidases, thiol-dependent peroxiredoxins and other specific oxidoreductases to detoxify ROS and RES. These defense mechanisms are often controlled by redox-sensitive transcription factors. B. subtilis encodes redox-sensing MarR-type regulators belonging to the OhrR and DUF24-families that are conserved among bacteria. Hence, we were further interested in this PhD thesis to study at the molecular and structural level the redox-sensing mechanisms of novel redox-sensing MarR/DUF24-type regulators in B. subtilis. We have characterized the regulatory mechanisms of HypR, YodB and CatR that sense and respond to hypochlorite, diamide and quinones stress. HypR is the first DUF24-family regulator whose crystal structure was resolved. HypR senses specifically disulfide stress and controls positively expression of the flavin oxidoreductase HypO after NaOCl and diamide stress. HypR resembles a 2-Cys-type regulator with a reactive nucleophilic N-terminal Cys14 and a second C-terminal Cys49. Besides HypR, B. subtilis encodes further MarR/DUF24-family members including the paralogous YodB and CatR repressors that sense quinones and diamide. YodB controls the azoreductase AzoR1, the nitroreductase YodC, and the Spx regulator. YodB resembles a 2-Cys-type MarR/DUF24-family regulator with three Cys residues (Cys6, Cys101, and Cys108) that form intermolecular disulfides in vivo under oxidative stress. YodB and its paralog CatR were further identified as repressors of the catDE operon encoding a catechol-2,3-dioxygenase that also contributes to quinone resistance. Although CatR is a 1-Cys-type regulator, our data showed that CatR also forms intermolecular disulfide in response to diamide and quinones in vitro. Thus, HypR, YodB and CatR are controlled by 2-Cys-type thiol-disulfide redox switches to sense disulfide and RES stress conditions, and to control specific RES detoxification enzymes.
  • Reaktive Sauerstoffspezies (ROS) können alle zellulären Makromoleküle schädigen und auch zur Entstehung von reaktiven elektrophilen Spezies (RES) führen als sekundäre reaktive Intermediate, wie z.B Chinone und Aldehyde. Niedermolekulare Thiolverbindungen (LMW Thiole) sind kleine Thiol-haltige Verbindungen, die eine wichtige Rolle besitzen in der Abwehr gegen ROS und RES in allen Organismen. Der am besten untersuchte zelluläre Thiol-Redoxpuffer ist Glutathion (GSH). GSH fehlt aber in Gram-positiven Bakterien. Bacillus und Staphylococcus-Spezies nutzen den neuen Redoxpuffer Bacillithiol (BSH) für die Aufrechterhaltung der Redoxbalance. Bei oxidativem Stress reagieren LMW-Thiole besonders mit Proteinthiolen unter Ausbildung von gemischten Proteindisulfiden, die als S-Thiolierungen bezeichnet werden und eine wichtige Rolle beim Proteinschutz aufweisen. Die Erforschung der Rolle des BSH-Redoxpuffers in der oxidativen Stressantwort und bei ROS-induzierten S-Thiolierungen in Firmicuten war ein Hauptziel der vorgelegten Promotionsarbeit. Die regulatorischen Mechanismen und post-translationalen Thiolmodifikationen als Antwort auf NaOCl-Stress wurden zunächst in Bacillus subtilis untersucht. NaOCl-Stress führte zur Induktion der thiol-spezifischen und oxidativen Stressregulons Spx, CtsR, PerR and OhrR. Mittels Redoxproteomik konnten nur wenige NaOCl-sensitive Proteine mit reversiblen Thioloxidationen identifiziert werden. Durch die ESI-Massenspektrometrie war es möglich, insgesamt 11 Proteine zu identifizieren, die in B. subtilis nach NaOCl-Stress zu gemischten Disulfiden mit Bacillithiol (BSH) oxidiert wurden, bezeichnet als S-bacillithiolierte Proteine. Methionine synthase MetE wurde mittels BSH-spezifischen Westernblotanalysen als Hauptprotein identifiert, welches in B. subtilis und anderen Bacillus-Spezies nach NaOCl-Stress S-bacillithioliert wird. Die S-Bacillithiolierung des OhrR-Repressors führt zur Induktion des OhrA-Peroxiredoxins welches zusammen mit dem BSH-Redoxpuffer Schutz gegen NaOCl-Stress vermittelt. Die S-Bacillithiolierung von MetE, YxjG, PpaC, und SerA verursacht NaOCl-Stress-induzierten Methionin-Hunger, was wiederum zur Induktion des S-Box-Regulons führt. In einer weiteren umfangreichen Redoxproteomanalyse haben wir die S-Bacillithiolome nach NaOCl-Stress in anderen Firmicutes untersucht beschrieben in. Insgesamt konnten so 54 S-bacillithiolierte Proteine identifiziert werden, von denen 29 Proteine unique und 8 konserviert waren. Funktionell sind S bacillithiolierte Protein beteiligt an der Biosynthese von Aminosäuren, Kofaktoren und Nukleotiden, der Translation, Proteinqualitätskontrolle und besitzen auch antioxidative Funktionen. Zusammenfassend zeigen unsere Daten eine Hauptrolle des BSH-Redoxpuffers in der Redoxregulation und beim Thiolschutz von konservierten und essentiellen Proteinen durch S-Bacillithiolierung in Firmicutes-Bakterien. Bakterien aktivieren nach Stress durch ROS und RES die Expression von antioxidativen Entgiftungsenzymen, wie z.B. Katalasen, Peroxidasen, thiol-abhängigen Peroxiredoxinen und anderen spezifischen Oxidoreduktasen zur Entgiftung von ROS und RES. Diese Entgiftungsenzyme sind oft kontrolliert durch redox-sensitive Regulatoren. B. subtilis besitzt redox-sensitive MarR-Typ Regulatoren der OhrR und DUF24-Familien, welche konserviert sind bei Bakterien. In dieser Promotionsarbeit haben wir weiterhin durch molekularbiologische, biochemische und genetische Methoden die Mechanismen der neuen redox-sensitiven Regulatoren der MarR/DUF24-Familie in B. subtilis untersucht, die beschrieben sind in den. Dabei wurden HypR, YodB und CatR als Redoxsensoren für Chinone, Diamid und NaOCl-Stress beschrieben. HypR ist der erste Regulator der DUF24-Familie, dessen Proteinkristallstruktur gelöst wurde. HypR ist ein spezifischer Redoxsensor für Disulfidstress und reguliert positiv die Expression der Nitroreduktase HypO nach NaOCl und Diamid-Stress. HypR ist ein Zwei-Cys-Typ Regulator mit einem reaktiven nukleophilen N-terminalen Cystein-14 und einem zweiten C-terminalen Cystein-49. B. subtilis besitzt weitere MarR/DUF24-Familie Regulatoren, wie z.B. die paralogen YodB und CatR-Repressoren als Redoxsensoren für Chinone und Diamid. YodB reguliert die Azoreduktase AzoR1, die Nitroreduktase YodC und den Spx-Regulator. YodB ist ein Regulator der Zwei-Cys-Typ MarR/DUF24-Familie mit drei Cysteinen (Cys6, Cys101, und Cys108). Das konservierte Cys6 ist essentiell für das Redox-sensing von Diamid und Chinonen in vivo. YodB und das paraloge CatR wurden auch als Repressoren des catDE-Operons charakterisiert, welches für eine Katechol-2,3-Dioxygenase kodiert und auch zur Resistenz gegenüber Chinonen beiträgt. CatR wird als Antwort auf Diamid und Chinone zu intermolekularen Disulfidbrücken oxidiert. Zusammenfassend konnten wir zeigen, dass HypR, YodB und CatR durch Zwei-Cys-Typ Thiol-Disulfid-Redoxswitches auf RES-Stress reagieren, um spezifische RES-Entgiftungsenzyme zu induzieren.

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Author: Khanh Chi Bui
Title Additional (English):Regulatory mechanisms of the disulfide stress response and the role of the bacillithiol redox buffer in Gram-positive bacteria
Title Additional (German):Regulatorische Mechanismen der Disulfidstress-Antwort und die Rolle des Bacillithiol-Redoxpuffers in Gram-positiven Bakterien
Advisor:Dr. Haike Antelmann
Document Type:Doctoral Thesis
Date of Publication (online):2013/05/07
Granting Institution:Ernst-Moritz-Arndt-Universität, Mathematisch-Naturwissenschaftliche Fakultät (bis 31.05.2018)
Date of final exam:2013/02/01
Release Date:2013/05/07
GND Keyword:Bakterien
Faculties:Mathematisch-Naturwissenschaftliche Fakultät / Abteilung für Mikrobiologie und Molekularbiologie
DDC class:500 Naturwissenschaften und Mathematik / 570 Biowissenschaften; Biologie