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Aktivierung der plasmatischen Gerinnung an der Monozytenoberfläche durch Sekretionsprodukte von Staphylococcus aureus

  • Im Rahmen dieser Arbeit standen Kulturüberstände von je 20 S. aureus-Stämmen von gesunden Probanden und von an einer Sepsis erkrankten Patienten zur Verfügung. Die verwendeten Kulturüberstände waren in Vorarbeiten unter anderem hinsichtlich ihrer Superantigeneigenschaften gut charakterisiert worden. Mittels eines Assays zur Bestimmung der procoagulatorischen Aktivität von Monozyten konnte nachgewiesen werden, dass S. aureus-Überstände konzentrationsabhängig eine TF-Aktivierung auf Monozyten induzieren. Dieser Effekt war nicht davon abhängig, ob es sich um ein Isolat gesunder Spender oder erkrankter Patienten handelte, auch die Menge an produziertem FXa durch einen Stamm aus Rachenabstrichen oder Blutkulturen unterschied sich nicht. Monozyten verschiedener Spender reagierten unterschiedlich auf den gleichen Kulturüberstand. Die Superantigen-Eigenschaften der Kulturüberstände nahmen keinen Einfluss auf die prokoagulatorische Aktivität von Monozyten. Sechs Kulturüberstände waren nicht in der Lage eine PCA zu induzieren, daher erfolgten verschiedene Untersuchungen zu Ermittlung der Zellvitalität. Im MTT-Test zeigte sich ein konzentrationsabhängiger zytotoxischer Effekt der Überstände, allerdings betrug der Anteil vitaler Zellen stets über 60 %. Ergänzende durchflusszytometrische Messungen konnten jedoch zeigen, dass Monozyten teilweise nur noch sporadisch nachweisbar waren. Um die prokoagulatorischen Eigenschaften der Sekretionsprodukte von S. aureus genauer zu charakterisieren, kamen der Laborstamm RN6390 und seine isogenetischen agr(-)- und sar(-)-Mutanten zum Einsatz. Der Wildtyp RN6390 sowie dessen Mutanten induzierten in hohen Konzentrationen eine geringere Faktor Xa-Generierung auf Monozyten als nur mit Medium behandelte Zellen. Während sich durch den Wildtyp und die agr(-)-Mutante auch in höheren Verdünnungsstufen keine PCA von Monozyten induzieren ließ, war dies mit der sar(-)-Mutante möglich. Dieses Aktivierungsmuster ließ sich auf ausgeprägte zytotoxische Eigenschaften zurückführen, sodass es nicht möglich war, den für die Faktor Xa-Generierung verantwortlichen Faktor genauer zu charakterisieren. Als eine mögliche Monozyten aktivierende Komponente untersuchten wir Peptidoglykan im Faktor Xa-Assay. Bereits geringste Konzentrationen von Peptidoglykan konnten eine PCA induzieren. In den Kulturüberständen selbst konnten wir PG semiquantitativ nachweisen. Ob Peptidoglykane allein oder in Synergie mit anderen Sekretionsfaktoren von S. aureus die TF-Aktivierung auslösen, ließ sich mit dieser Arbeit nicht abschließend klären.
  • Twenty S. aureus isolates from throat swabs of asymptomatic carriers and 20 clinical S. aureus isolates from blood cultures of patients with septicaemia were obtained. The S. aureus isolates used in this work were characterised concerning there superantigene patterns by a collaborating working group. To address the question, whether S. aureus-derived soluble factors can activate blood cell-related clotting, we investigated the procoagulatory capacity of these stains by a procoagulant assay for monocytes. The S. aureus supernatants induced a procoagulatory surface on monocytes. There was no difference between commensal and invasive isolates. In most cases the procoagulant activity was strongly concentration-dependent. Commensal and invasive strains were similarly effective. Six supernatants of S. aureus were not able to induce a significant procoagulant activity. Assuming that cell lysis might be a possible explanation, different examinations for determining the cytotoxicity of supernatants were performed. Via MTT conversion a concentration dependent cytotoxic effect auf S. aureus isolates was shown but the proportion of vital cells was always above 60 %. Flow cytometric data indicates monocyte destruction by a reduction in the CD14-positive cell population. Culture supernatants from the laboratory strain RN6390 and its isogenic mutants agr(-) and sar(-) were compared to assess the role of these global regulators for the release of procoagulatory factors by S. aureus. In monocytes, supernatants from the wild type strain RN6390 and its agr(-) mutant were not able to induce a procoagulant activity. The supernatant of the sar(-) mutant induced procoagulant activity in a concentration-dependent manner. Interestingly high concentrations of the culture supernatants did not cause FXa generation on monocytes but even lower FXa generation than in the buffer control. This was correlated with disappearance of the CD14 positive cell population as determined by FACS analysis indicating the release of factors toxic for monocytes by RN6390 and its mutants. Because of this cytotoxic effect it was not possible to further characterize the procoagulant factor in this experimental setting. As a potential pocoagulant factor we used peptidoglycan to activate monocytes. Purified peptidoglycans in very low concentrations induced a tissue-factor dependent procoagulant surface on monocytes in a dose-dependent manner in our experimental setting. It was shown that peptidoglycan was present in supernatants of S. aureus by a semiquantitative assay. Whether peptidoglycans alone or in synergy with other soluble factors were responsible for TF-activation on monocytes could not be answered in this work.

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Metadaten
Author: Jana Hellriegel
URN:urn:nbn:de:gbv:9-001533-6
Title Additional (English):Procoagulant activity in human monocytes induced by secretion products of stapylococcus aureus
Advisor:Prof. Dr. Andreas Greinacher
Document Type:Doctoral Thesis
Language:German
Date of Publication (online):2013/06/18
Granting Institution:Ernst-Moritz-Arndt-Universität, Universitätsmedizin (bis 31.05.2018)
Date of final exam:2013/04/15
Release Date:2013/06/18
GND Keyword:Gerinnungsfaktor III, Koagulation, Staphylococcaceae, Verbrauchskoagulopathie
Faculties:Universitätsmedizin / Institut für Immunologie u. Transfusionsmedizin - Abteilung Transfusionsmedizin
DDC class:600 Technik, Medizin, angewandte Wissenschaften / 610 Medizin und Gesundheit