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Untersuchung des pUL31- und pUL34-unabhängigen Kernaustritts des Pseudorabies Virus

  • Der Kernaustritt der Nukleokapside stellt einen essentiellen Schritt im Replikationszyklus der Herpesviren dar. Aufgrund seiner Größe kann das Kapsid den Kern nicht durch die Kernporen verlassen, sondern wird durch die Kernmembranen transportiert. Die viralen Proteine pUL34 und pUL31 bilden den NEC (nuclear egress complex), der virale und zelluläre Kinasen an die Kernmembran rekrutiert. Diese phosphorylieren die Lamine, wodurch sich die Lamina partiell auflöst und das Nukleokapsid Zugang zur Kernmembran erhält. Die Deletion einer oder beider Komponenten des NEC bewirkt zwar eine deutliche Reduktion der viralen Titer, jedoch wird eine geringe Menge infektiöser Nachkommenviren freigesetzt, die für eine Reversionsanalyse genutzt wurde. Dafür wurde zuerst das UL34-negative Virus und später auch das UL31-negative Virus, auf Kaninchennierenzellen (RK13) seriell passagiert, bis im Überstand Wildtyp-ähnliche Titer erreicht wurden. Aus diesen Überständen wurden Virusmutanten isoliert, die ohne den NEC effizient replizierten und als PrV-ΔUL34Pass bzw. PrV-ΔUL31Pass bezeichnet wurden. Elektronenmikroskopische Aufnahmen zeigten, dass die passagierten Viren nicht mehr wie der PrV-Wildtyp durch die Kernmembran transportiert, sondern durch eine partiell aufgelöste Kernmembran ins Zytoplasma freigesetzt wurden. Das Ziel dieser Arbeit war zu untersuchen, wie die Freisetzung der Kapside aus dem Kern ohne den essentiellen NEC abläuft. Um zu ermitteln, welche viralen Proteine für die Auflösung der Kernmembran von Bedeutung sein könnten, wurde zunächst das komplette Genom von PrV-ΔUL34Pass sequenziert und mit dem des Wildtyps (PrV-Ka) und der nicht passagierten UL34-Deletionsmutante (PrV-ΔUL34) verglichen. Die mutierten Gene wurden anschließend in PrV-ΔUL31Pass sequenziert. Zu den sieben Genen, die in beiden passagierten Viren verändert sind, gehören u.a. UL21, UL26, UL46 und UL49. Jedoch konnte durch Deletion der einzelnen mutierten Gene nicht geklärt werden, welches Genprodukt für die Kernmembran-Fragmentierung in PrV-ΔUL34Pass- oder PrV-ΔUL31Pass infizierten Zellen bzw. für die Stabilisierung der Kernmembran während der Wildtyp-Infektion verantwortlich ist. Mit Hilfe von Inhibitorstudien wurde untersucht, welche zellulären Prozesse von den passagierten Viren manipuliert werden könnten, um die Kernmembran-Fragmentierung zu induzieren. Der Cdk (Cyclin dependent kinase) 1, Cdk2 und Cdk5-Inhibitor Roscovitin, der in höheren Dosen auch ERK1/2 (extracellular regulated kinase 1/2) hemmt, reduzierte die Titer der passagierten Viren deutlich, während der PrV-Wildtyp kaum beeinflusst wurde. Einen ähnlichen Effekt konnte auch mit einem Inhibitor für die ERK1/2 vorgeschaltete Kinase MEK1/2 (mitogen activated protein kinase/ERK kinase 1/2) erzielt werden. Spezifische Inhibitoren von ERK1/2, Cdk1, Cdk2 oder Cdk5 zeigten jedoch keinen spezifischen Einfluss auf die passagierten Virusmutanten oder den Wildtyp. Zur selben Zeit konnte eine andere Arbeitsgruppe zeigen, dass das Varizella Zoster Virus pUL46 Homolog ORF12 die Aktivierung von ERK1/2 induziert (Liu et al., J. Virol. 86, 2012). Basierend auf dieser Studie wurde untersucht, ob PrV pUL46 ebenfalls ERK1/2 aktivieren kann und ob diese Aktivierung für die Auflösung der Kernmembran von Bedeutung ist. Es konnte gezeigt werden, dass sowohl PrV-Wildtyp als auch PrV-ΔUL34Pass pUL46 ERK1/2 und die entsprechenden Zielgene aktivierte. Die Deletion von UL46 aus dem Genom der passagierten Viren resultierte außerdem in einem deutlich höheren Anteil von Zellen mit einer fragmentierten Kernmembran, wobei dies nicht ausschließlich auf die Aktivierung von ERK1/2 durch pUL46 zurückgeführt werden kann, da sich die beiden passagierten Viren in ihrem ERK-Aktivierungspotential unterscheiden. Während PrV-ΔUL31Pass ERK1/2 vergleichbar zum Wildtyp induzierte, war die Aktivierung durch PrV-ΔUL34Pass deutlich geringer. Diese Abweichung lässt sich nicht auf die unterschiedlichen pUL46-Proteine der beiden passagierten Virusmutanten zurückführen, da der Austausch der jeweiligen UL46 Sequenzen gegen Wildtyp UL46 das ERK1/2-Aktivierungsmuster nicht veränderte. Somit scheint pUL46 einen Einfluss auf die Stabilität der Kernmembran und die Aktivierung von ERK zu haben. Beide passierte Viren bilden verstärkt Synzytien im Vergleich zum PrV-Wildtyp oder den nicht-passagierten Vorläufern aus. Um zu untersuchen, ob diese Deregulierung der Membranfusion auch die Kernmembranen betrifft und möglicherweise eine Ursache für die Fragmentierung sein könnte, wurden die Glykoproteine gB und gH aus den Genomen der passagierten Virusmutanten deletiert. Elektronenmikroskopische Aufnahmen sowie Untersuchungen von Replikationsverhalten und Plaquebildung ergaben, dass die Fragmentierung der Kernmembran auch in Abwesenheit von gB oder gH stattfindet. Dagegen sind beide Glykoproteine, wie auch im PrV-Wildtyp, für die Virusreplikation essentiell.
  • The nuclear egress of nucleocapsids is an essential step in the herpesviral replication cycle. Due to its size, the capsid cannot exit the nucleus through the nuclear pores, but instead is transported through the nuclear membrane. The viral proteins pUL34 and pUL31 form the nuclear egress complex (NEC), which recruits cellular and viral kinases to the nuclear membrane. There they phosphorylate lamins, which results in the local dissolution of the nuclear lamina and allows access of the nucleocapsids to the nuclear membrane. Deletion of one or both components of the NEC causes a significant reduction in viral titers but even in absence of the NEC, a few infectious virions are produced, which were used for reversion analysis. Therefore, first the UL34-negative and later also the UL31-negative PrV were passaged on rabbit kidney cells (RK13) until titers in the supernatant were similar to PrV-wildtype. From this supernatant single plaques were picked. These viruses replicated efficiently in the absence of the NEC and were designated as PrV-ΔUL34Pass and PrV-ΔUL31Pass, respectively. Ultrastructural analysis showed that the passaged viruses were not transported through the nuclear membrane like PrV-wildtype but through a fragmented nuclear envelope thereby releasing nucleocapsids into the cytosol. The aim of this study was to examine how nuclear egress functions without the NEC. In order to identify the mutated viral proteins which are important for nuclear envelope breakdown (NEBD), first the complete genomic sequence of PrV-ΔUL34Pass was determined and compared to PrV-wildtype (PrV-Ka) and the nonpassaged parental PrV-ΔUL34. The mutated genes found in PrV-ΔUL34Pass were subsequently sequenced in PrV-ΔUL31Pass. Among the seven genes altered in both passaged viruses are UL21, UL26, UL46 and UL49. However, single deletion of either of these genes shed no light on which gene product is responsible for NEBD in PrV-ΔUL34Pass- or PrV-ΔUL31Pass-infected cells or for the stabilization of the nuclear membrane during herpesvirus infection. Different inhibitors were used to analyze which cellular processes are manipulated by the passaged viruses to induce NEBD. The Cdk (Cyclin dependent kinase) 1, Cdk2 and Cdk5-inhibitor Roscovitine, which also blocks ERK1/2 (extracellular regulated kinase 1/2) when used in higher doses, reduced the titers of the passaged viruses clearly, whereas PrV-wildtype was hardly affected. A similar effect could be achieved with an inhibitor for the kinase upstream of ERK1/2, MEK1/2 (mitogen-activated protein kinase/ERK kinase 1/2). Specific ERK1/2, Cdk1, Cdk2 or Cdk5 inhibitors, however, showed no specific effect on the passaged viruses. At the same time another research group showed that the varicella-zoster virus pUL46 homologue ORF12 induces ERK1/2 activation (Liu et al., J. Virol. 86, 2012). Based on that study, it was analyzed if PrV pUL46 activates ERK1/2 and whether pUL46 plays a role in nuclear membrane fragmentation or stabilization. It could be shown that PrV-wildtype and PrV-ΔUL34Pass pUL46 activate ERK1/2 and its nuclear target genes. Furthermore, the deletion of UL46 from the genomes of the passaged viruses resulted in an increased fraction of cells showing NEBD. However, this effect could not be exclusively explained by the activation of ERK1/2 through pUL46, since PrV-ΔUL31Pass and PrV-ΔUL34Pass act differently on ERK1/2. Whereas PrV-ΔUL31Pass activates ERK1/2 comparable to PrV-wildtype, the activation of ERK1/2 after infection with PrV-ΔUL34Pass is clearly reduced. The different ERK1/2 activation potential cannot be explained by the variations in the UL46 proteins of the two passaged mutants, because the replacement of the mutated UL46 in either passaged virus against wildtype UL46 did not change the ERK1/2 activation potential. Thus, pUL46 is important for nuclear envelope stabilization and ERK1/2 activation. PrV-ΔUL31Pass as well as PrV-ΔUL34Pass form extensive syncytia. To test whether this deregulation of membrane fusion activity also affects the nuclear membranes and might therefore be involved in NEBD, the glycoproteins gB and gH were deleted from both passaged viruses. Electron microscopic examination, as well as the analysis of replication kinetics and plaque formation showed that NEBD is not dependent on presence of gB or gH. However, as in PrV-wildtype both glycoproteins are essential for efficient replication.

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Metadaten
Author: Katharina Stephanie Schulz
URN:urn:nbn:de:gbv:9-001794-5
Title Additional (English):Analysis of Pseudorabies Virus pUL31- and pUL34- independent nuclear egress
Advisor:Prof. Dr. Dr. h.c. Thomas C. Mettenleiter
Document Type:Doctoral Thesis
Language:German
Date of Publication (online):2014/04/15
Granting Institution:Ernst-Moritz-Arndt-Universität, Mathematisch-Naturwissenschaftliche Fakultät (bis 31.05.2018)
Date of final exam:2014/04/11
Release Date:2014/04/15
Tag:ERK-Signalkaskade, Fragmentierung der Kernmembran, Passagieren
nuclear envelope breakdown
GND Keyword:Herpesvirus, Pseudorabies Virus
Faculties:Mathematisch-Naturwissenschaftliche Fakultät / Abteilung für Mikrobiologie und Molekularbiologie
DDC class:500 Naturwissenschaften und Mathematik / 570 Biowissenschaften; Biologie