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Impact of non-thermal plasma on cell signaling in keratinocytes

  • There is a growing interest in the application of non-thermal atmospheric pressure plasma for the treatment of wounds. Due to the generation of various ROS and RNS, UV radiation and electric fields plasma is a very promising tool which can stimulate skin and immune cells. However, not much is known about the mammalian cell responses after plasma treatments on a molecular level. The present work focusses on the impact of plasma on cell signaling in the human keratinocyte cell line HaCaT by using the methods DNA microarray, qPCR, ELISA and flow cytometry. Here, cell signaling mediators such as cytokines and growth factors which could promote wound healing by enhancing angiogenesis, reepithelization, migration and proliferation were of major interest. Additionally, the crosstalk between keratinocytes and monocytes was studied using a co-culture. For the first time extensive investigations on the impact of plasma on cell signaling in human keratinocytes were conducted. The most prominent cytokines and growth factors which were regulated by plasma at gene and protein level were VEGF-A, GM-CSF, HB-EGF, IL-8, and IL-6. The latter was not activated due to the JAK/STAT-pathway but probably by a combined activation of MAPK- and PI3K/Akt-pathways. By the use of conditioned medium it was found out that ROS and RNS generated directly after plasma treatment induced larger effects on cell signaling in keratinocytes than the subsequently secreted growth factors and cytokines. Furthermore, monocytes and keratinocytes hardly altered their secretion profiles in co-culture. From these results it is deduced that the plasma generated reactive species are the main actors during cell signaling. In order to differentiate the impact of ROS and RNS on the cellular response the ambience of the plasma effluent was controlled, varying the ambient gas composition from pure nitrogen to pure oxygen. Thereby a first step towards the attribution of the cellular response to specific plasma generated reactive species was achieved. While IL-6 expression correlated with ROS generated by the plasma source, the cell signaling mediators VEGF-A, GM-CSF and HB-EGF were significantly changed by RONS. Above all hydrogen peroxide was found to play a dominant role for observed cell responses. In summary, plasma activates wound healing related cell signaling mediators as cytokines and growth factors in keratinocytes. It was also shown that the generated reactive species mainly induced cell signaling. For the first time cell responses can be correlated to ROS and RONS in plasma treated cells. These results underline the potential of non-thermal atmospheric pressure plasma sources for their applications in wound treatment.
  • Das Interesse an einer Anwendung von nichtthermalem Atmosphärendruckplasma zur Behandlung von Wunden wächst stetig. Durch die Erzeugung von reaktiven Sauerstoffspezies (ROS), reaktiven Stickstoffspezies (RNS), UVStrahlung und elektrischen Feldern ist Plasma für eine medizinische Anwendung äußerst vielversprechend. Durch Plasmabehandlungen können sowohl Haut- als auch Immunzellen stimuliert werden. Dennoch sind Zellantworten auf molekularer Ebene weitestgehend unerforscht. In der vorliegenden Arbeit wurde der Einfluss von Plasma auf die Signaltransduktion in der humanen Keratinozytenzelllinie HaCaT mittels DNA microarray, qPCR, ELISA und Durchflußzytometer untersucht. Der Fokus lag hierbei auf Signalmolekülen wie Zytokinen und Wachstumsfaktoren, welche den Wundheilungsprozess durch Förderung von Angiogenese, Reepithelisierung, Migration und Proliferation stimulieren können. Zur Untersuchung der Kommunikation zwischen Haut- und Immunzellen wurde zusätzlich eine Ko-Kultur mit Keratinozyten (HaCaT Zelllinie) und Monozyten (THP-1 Zelllinie) durchgeführt. Erstmalig wurden umfangreiche Untersuchungen zur Signaltransduktion in einer humanen Keratinozytenzelllinie nach Plasmabehandlung durchgeführt. Die wichtigsten Zytokine und Wachstumsfaktoren, welche sowohl auf Genals auch auf Proteinebene durch Plasma aktiviert wurden, sind VEGF-A, HB-EGF, GM-CSF, IL-8 und IL-6. Es konnte zudem gezeigt werden, dass IL-6 nicht über den JAK/STAT-Signalweg, sondern vermutlich durch eine kombinierte Aktivierung vom MAPK- und PI3K/Akt-Signalwegen stimuliert wurde. Des Weiteren konnte mittels konditioniertem Medium gezeigt werden, dass die plasmagenerierten ROS und RNS einen höheren Einfluss auf die Signaltransduktion hatten, als die darauffolgende Ausschüttung von Zytokinen undWachstumsfaktoren. Die Sezernierung von Signalmolekülen in den ko-kultivierten Keratinozyten und Monozyten war im Vergleich zu den jeweiligen Mono-Kulturen kaum verändert. Dies ist ein weiteres Indiz dafür, dass die durch Plasma gebildeten reaktiven Spezies die Hauptrolle bei der Signaltransduktion während der Plasmabehandlung spielen. Um den Einfluss von ROS und RNS in der Zellantwort zu differenzieren wurde die Umgebung vom Plasmaeffluenten kontrolliert. Die Zusammensetzung des Umgebungsgases wurde von reinem Sauerstoff zu reinem Stickstoff variiert. Hierdurch wurde ein erster Schritt hin zur Zuordnung von Zellantworten zu plasmagenerierten reaktiven Spezies gemacht. Während die IL-6 Expression mit ROS korreliert, werden VEGF-A, GM-CSF und HB-EGF durch RONS stimuliert. Darüber hinaus wurde Wasserstoffperoxid, welches durch Plasma gebildet wird, als besonders bedeutend für die Zellantwort identifiziert. Zusammenfassend konnte gezeigt werden, dass Plasma wichtige Signalmoleküle für die Wundheilung in Keratinozyten aktiviert. Die Zytokine und Wachstumsfaktoren wurden größtenteils durch die reaktiven Spezies stimuliert. Zudem konnte erstmalig gezeigt werden, dass die plasmainduzierten Zellantworten mit ROS und RONS korrelieren. Die erzielten Ergebnisse unterstreichen das Potential von Atmosphärendruck-Plasmaquellen für die Anwendung in der Wundbehandlung.

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Metadaten
Author: Annemarie Barton
URN:urn:nbn:de:gbv:9-001807-3
Title Additional (English):Impact of non-thermal plasma on cell signaling in keratinocytes
Title Additional (German):Einfluss von nicht-thermalem Plasma auf die Zellsignaltransduktion in Keratinozyten
Advisor:Prof. Dr. Ulrike Lindequist
Document Type:Doctoral Thesis
Language:English
Date of Publication (online):2014/04/28
Granting Institution:Ernst-Moritz-Arndt-Universität, Mathematisch-Naturwissenschaftliche Fakultät (bis 31.05.2018)
Date of final exam:2014/04/24
Release Date:2014/04/28
Tag:cell signaling, keratinocyte, plasma, wound healing
GND Keyword:Keratinozyt, Plasma, Signaltransduktion, Wundheilung
Faculties:Mathematisch-Naturwissenschaftliche Fakultät / Institut für Pharmazie
DDC class:500 Naturwissenschaften und Mathematik / 570 Biowissenschaften; Biologie