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Entwurf, Synthese und Evaluierung antiproliferativer Leitstrukturen und komplementärer Substanzbibliotheken

  • Durch die vorliegende Arbeit wurde die Relevanz moderner Ansätze in der fragmentbasierten Leitstrukturentwicklung für den Erfolg und die Sicherheit in der Arzneistoffentwicklung aufgezeigt. Neben den theoretischen Grundlagen konnte die praktische Anwendung molekularer Vielfalt mit Hilfe komplementärer Substanzbibliotheken vielfach direkt den resultierenden Nutzen aufzeigen. Dabei galt das Interesse speziell antiproliferativen Zielstrukturen, mit besonderem Schwerpunkt auf der Hemmung der Glutathionperoxidase. Des Weiteren unterstützten in silico-Methoden eine zielgerichtete Arbeitsweise. Durch die Optimierung des GPx 1-Testsystems konnte eine zuverlässige in vitro-Analytik etabliert werden. Zusammenfassend lässt sich festhalten, dass mit Hilfe der angestellten Untersuchungen die erfolgreiche Entwicklung, Optimierung und Evaluierung mehrerer Leitstrukturen für diverse Zielproteine der Tumortherapie aufgezeigt werden konnte. Es wurden zunächst die Fortschritte auf dem Gebiet der fragmentbasierten Leitstrukturentwicklung über multifunktionale Screeningbibliotheken zusammengefasst und bewertet (Publikation 1). Die vorgestellten Ansätze, wie Halogenbindungen und sp3-Reichtum, fanden in den folgenden Publikationen zu einem Großteil praktische Anwendung. Die Synthese einer umfangreichen Acylhydrazonbibliothek führte zum Ausbau der inhibitorischen Aktiviät gegenüber der bovinen GPx 1 (Publikation 2). Der kombinatorische Syntheseansatz erbrachte eine Vielzahl eng verwandter Analoga, die entgegen der Erwartungen leider kaum Erkenntnisse über SAR erbrachten. Zudem erwiesen sich die angewandten Docking-Studien als irreführend, da keinerlei Korrelation zu den in vitro-Ergebnissen erkennbar war. Dennoch konnte mit den angestellten Untersuchungen ein stabiler Enzymassay etabliert werden, der eine zuverlässige Analyse zukünftiger Produkte unterstützt. Langfristig wäre für Aussagen über quantitative SAR die gezielte Optimierung anhand einer Kristallstrukturanalyse erforderlich. Alternativ wurden bereits erste NMR-Versuche mit Sättigungstransfer-Differenz (STD)-Spektroskopie angestellt, die sich jedoch aufgrund der schlechten Löslichkeit der Acylhydrazone als schwierig erwiesen. Weiterhin wurde Misonidazol als Inhibitor der GPx 1 einer Neubewertung unterzogen (Publikation 3). Während racemisches Misonidazol nach früheren Berichten die Aktivität muriner GPx 1 bei 500 µM signifikant reduzierte, zeigte die in vitro-Testung der reinen Enantiomere gleicher Konzentration an boviner GPx 1 keine inhibitorische Wirkung. Von wissenschaftlichem Nutzen war zudem die Erkenntnis über einen schwachen, aber nachweisbar signifikanten Synergismuseffekt des Racemats verglichen mit den isolierten Enantiomeren. Die ergänzende Beschreibung dieser noch wenig untersuchten Wirkungspotenzierung liefert einen Beitrag zum gesamtheitlichen Verständnis dieses Phänomens. Alle synthetisierten Endstufen sowie ausgewählte Zwischenstufen wurden in einer öffentlich zugänglichen Screeningplattform, dem FMP in Berlin, hinterlegt (Publikation 4). Sie haben als Gemeinsamkeit eine ausgeprägte Reaktionsbereitschaft, wodurch in zukünftigen biologischen Screenings eine gezielte oder auch zufällige Entdeckung neuartiger Interaktionen nicht abwegig ist. Die nukleophilen Verbindungen 1, 2, 4 und 5 könnten mit basischen Aminosäuren, wie dem Histidin der Serinproteasen, oder mit Metalloenzymen wechselwirken, während durch die gezielte Elektrophilie von 3 kovalente reversible Bindungen mit Cysteinresten und deren Selen-Analoga zu erwarten sind. Der Beitrag fragmentbasierter Substanzbibliotheken zur Leitstrukturentwicklung konnte am Beispiel der 4-Amidocyclopentan-1,3-diole gezeigt werden (Publikation 5). Ausgehend von acht trisubstituierten Cyclopentan-Templaten konnte die Synthese von achtzig Produkten mit zum Teil potenter Wirkung gegen mehrere Tumor-Zelllinien beschrieben werden. Die Substanzbibliothek dieser Studie demonstriert den Einsatz moderner Methoden zur Bereitstellung von Werkzeug für offene Fragen der Molekularbiologie aus einem bisher zu wenig bearbeiteten Bereich des chemischen Strukturraums. Mit Hilfe von in silico-Untersuchungen gelang eine gezielte Synthese neuartiger Inhibitoren NAD+-abhängiger Histondeacetylasen (Publikation 6). Die resultierende Klasse N1-substituierter Benzimidazolthione zeichnete sich durch erhöhte physiologische Stabilität gegenüber der Leitstruktur Splitomicin aus. Obgleich eine vollständig selektive Inhibition zwischen den Sirtuinen 1–3 nicht erreicht wurde, gelang durch die Anwendung computergestützter Methoden die Synthese eines potenten Inhibitors mit selektiver Wirkung gegen Sirtuin 1 und 2, dessen Grundgerüst als Leitstruktur weiterer Untersuchungen dienen kann.
  • The relevance of modern approaches to fragment-based lead discovery for the success and safety in drug development was demonstrated by the present work. In addition to the theoretical principles the practical application of molecular diversity with the help of complementary compound libraries could often directly illustrate the resulting benefits. Special interests were given to antiproliferative targets, with particular emphasis on the inhibition of glutathione peroxidase. Furthermore, in silico methods supported targeted syntheses. By optimizing the GPx 1 test system a reliable in vitro analysis could be established. In summary it can be stated that the successful development, optimization and evaluation of multiple leads could be demonstrated for a variety of target proteins in tumor therapy by the help of the employed studies. Initially, progress in the field of fragment-based lead discovery via multipurpose screening libraries were reviewed and evaluated (publication 1). The presented approaches, such as halogen bonding and sp3-wealth, were put into practice within the following publications to a large extent. The synthesis of an extensive acylhydrazone library led to an increased inhibition against the bovine GPx 1 (publication 2). The combinatorial synthesis approach yielded a large number of closely related analogs, which unfortunately provided little knowledge about SAR contrary to expectations. In addition, the applied docking studies proved to be misleading, since no correlation was evident to the in vitro results. Nevertheless, a stable enzyme assay was established with the studies employed, which supports a reliable analysis of future products. The specific optimization based on a crystal structure analysis would be required for quantitative statements about SAR in the long term. Alternatively, initial NMR experiments with saturation transfer difference (STD) spectroscopy were already employed, but proved to be difficult due to the poor solubility of the acylhydrazones. Furthermore, misonidazole was revaluated as an inhibitor of GPx 1 (publication 3). According to previous reports racemic misonidazole reduced the activity of murine GPx 1 at 500 µM significantly. The in vitro testing of the pure enantiomers at the same concentrations on bovine GPx 1 resulted in no inhibitory effect. Scientific interest was created by the finding of a weak but significant joint effect of the racemate compared to the isolated enantiomers. The supplementary description of this little studied effect contributes to the holistic understanding of the synergistic phenomenon. All synthesized products as well as its pre-stages were published in a open access screening platform, the FMP in Berlin (publication 4). They all have a pronounced reactivity in common, whereby a targeted or random discovery of novel interactions is reasonable in future biological screenings. The nucleophilic compounds 1, 2 , 4 and 5 could interact with basic amino acids such as histidine of serine proteases or with metallo enzymes, while one could expect reversible covalent bonds with cysteine residues and their selenium analogs by the targeted electrophilicity of 3. The contribution of fragment-based compound libraries for lead discovery could be demonstrated on the example of 4-Amidocyclopentan-1,3-diols (publication 5). Starting with eight trisubstituted cyclopentane templates we synthesized eighty products, which in part revealed potent activity against a number of tumor cell lines. The compound library of this study demonstrates the use of modern methods to provide a tool for open questions in molecular biology from a far too little processed area of chemical space. By means of in silico studies a targeted synthesis of novel inhibitors of NAD+-dependent histone deacetylases was achieved (publication 6). The resulting N1-substituted Benzimidazolthione was characterized by increased physiological stability compared to the lead compound Splitomicin. Although a completely selective inhibition between the sirtuins 1-3 was not achieved, the synthesis of a potent inhibitor with selective activity against sirtuin 1 and 2 was achieved by the use of computer-based methods and may now serve as a lead structure for further investigations.

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Metadaten
Author: Felix Wilde
URN:urn:nbn:de:gbv:9-001824-9
Title Additional (English):Design, synthesis and evaluation of antiproliferative leads and complementary compound libraries
Advisor:Prof. Dr. Andreas Link
Document Type:Doctoral Thesis
Language:German
Date of Publication (online):2014/05/20
Granting Institution:Ernst-Moritz-Arndt-Universität, Mathematisch-Naturwissenschaftliche Fakultät (bis 31.05.2018)
Date of final exam:2014/05/13
Release Date:2014/05/20
Tag:Mikrowellensynthese, in silico Wirkstoffdesign, in-vitro Evaluierung
GND Keyword:Arzneimitteldesign, Molecular modeling, Organische Synthese
Faculties:Mathematisch-Naturwissenschaftliche Fakultät / Institut für Pharmazie
DDC class:500 Naturwissenschaften und Mathematik / 540 Chemie