Bitte verwenden Sie diesen Link, wenn Sie dieses Dokument zitieren oder verlinken wollen: https://nbn-resolving.org/urn:nbn:de:gbv:9-001936-8

Untersuchungen zum Einfluss von physikalischem Plasma auf in vitro kultivierte Zellen

  • Im Fokus dieser Arbeit standen die Wechselwirkungen zwischen nicht-thermischem Atmosphärendruck-Plasma und in-vitro kultivierten Keratinozyten (HaCaT-Keratinozyten) und Melanomzellen (MV3). Für die Untersuchungen wurden drei Plasmaquellen unterschiedlicher Bauart genutzt; ein Plasmajet (kINPen 09) und zwei Quellen, die das Plasma mittels der dielektrisch behinderten Entladung (Oberflächen-DBE, Volumen-DBE) generieren. Um grundlegende Effekte von Plasma auf Zellen analysieren zu können, wurde zunächst der Einfluss von physikalischem Plasma auf die Vitalität; die DNA und die Induktion von ROS untersucht. Folgende Methoden wurden verwendet: - Vitalität: - Neutralrotassay, Zellzählung (Zellzahl, Zellintegrität) - BrdU-Assay (Proliferation) - Annexin V und Propidiumiodid- Färbung, Durchflusszytometrie (Induktion von Apoptose) - DNA: - Alkalischer Comet Assay (Detektion von DNA-Schäden) - DNA-Färbung mit Propidiumiodid, Durchflusszytometrie (Zellzyklusanalyse) - ROS: - H2DCFDA-Assay, Durchflusszytometrie (Bestimmung der ROS-positiven Zellen) Neben den Folgen die die Plasmaquellen induzieren wurde weiterhin untersucht, welchen Einfluss das Behandlungsregime (direkt, indirekt, direkt mit Mediumwechsel), das Prozessgas (Argon, Luft) und die zellumgebenden Flüssigkeiten (Zellkulturmedien: IMDM, RPMI; Pufferlösungen: HBSS, PBS) auf das Ausmaß der Plasma-Zell-Effekte hatten. Die Verwendung aller Plasmaquellen führte in HaCaT-Keratinozyten und Melanomzellen (MV3) zu Behandlungszeit-abhängigen Effekten: - Verlust an vitalen Zellen und verminderte Proliferationsfähigkeit - Induktion von Apoptose nur nach den längsten Plasmabehandlungszeiten - DNA-Schäden 1 h nach Plasmabehandlung, nach 24 h deutlich weniger bzw. nicht mehr nachweisbar, Hinweise für DNA-Reparatur vorhanden - Zellzyklusarrest in der G2/M-Phase zulasten der G1-Phase 24 h nach Plasmabehandlung - Anstieg der ROS-positiven Zellen 1 h und 24 h nach Plasmabehandlung Es wurde gezeigt, dass in RPMI-Medium kultivierte Zellen sensitiver, in Form von verminderter Vitalität und vermehrten DNA-Schäden, reagierten als in IMDM-Medium gehaltene Zellen. Aber auch während der Plasmabehandlung in Pufferlösungen (HBSS, PBS) gehaltene HaCaT-Zellen wiesen DNA-Schäden auf. Die direkte und indirekte Plasmabehandlung führte zu nahezu gleichen Ergebnissen. Ein Wechsel des Zellkulturmediums direkt nach der Plasmabehandlung schwächte alle gemessenen Effekte ab. Daraus kann geschlussfolgert werden, dass neben der Art der Flüssigkeit und Behandlungszeit auch der Inkubationszeitraum der Zellen mit der in Plasma in Kontakt gekommenen Flüssigkeit von essentieller Bedeutung ist. Die durch Plasma induzierten reaktiven Spezies gelangen in die Flüssigkeit und interagieren mit den Wassermolekülen und den organischen Molekülen der Zellkulturmedien, welche langlebige Radikale (z.B. H2O2) bilden, die dann ihrerseits mit zellulären Molekülen reagieren. Die anderen Plasmakomponenten wie UV-Licht und elektrische bzw. magnetische Feldern scheinen nur eine untergeordnete Rolle in der Plasma-Zell-Interaktion zu spielen, da diese nur bei der direkten Behandlung mit den Zellen in Berührung kommen und die starken Auswirkungen nach der indirekten Behandlung nicht verursachen können. Die in diesen Untersuchungen verwendete Oberflächen-DBE konnte mit Luft oder mit Argon als Prozessgas betrieben werden. Wurde Argon als Prozessgas genutzt, kam es zu milderen Auswirkungen im Vergleich zur Plasmabehandlung im Luftmodus. Mit Luft generiertes Plasma weist neben ROS auch RNS in der Gasphase auf, letztere lassen sich im Argon-Plasma nicht nachweisen und stehen für Plasma-Zell-Interaktionen nicht zur Verfügung. Zusätzlich zu den humanen Keratinozyten wurden auch humane Melanomzellen mit Plasma (Oberflächen-DBE/Luft) behandelt. Im Vergleich zu den HaCaT-Zellen sind bei den MV3-Zellen geringere Behandlungszeiten nötig, um biologisch gleichwertige Effekte zu bewirken. Die hier verwendeten Testmethoden eignen sich für die biologische Charakterisierung von neuen Plasmaquellen bzw. für die Analyse von Plasma-Zell-Wechselwirkungen weiterer Zelllinien. Tiefergehende Untersuchungen, z.B. bezüglich der genaueren Spezifizierung der durch Plasma hervorgerufenen oxidativen DNA-Schäden und den daraus resultierenden Reparaturmechanismen, sollten folgen.
  • This study focused on the interactions of non thermal atmospheric pressure plasma on in vitro cultured keratinocytes (HaCaT keratinocytes) and melanoma cells (MV3). Three different plasma sources were used: a plasma jet (kINPen 09), a surface DBD (dielectric barrier discharge) and a volume DBD. For analyzing basic effects of plasma on cells, influence of physical plasma on viability, on DNA and on induction of ROS were investigated. Following assays were used: Viability: - neutral red uptake assay, cell counting (number of viable cells, cell integrity) - BrdU assay (proliferation) - Annexin V and propidium iodide staining, flow cytometry (induction of apoptosis) DNA: - alkaline comet assay (detection of DNA damage) - staining of DNA with propidium iodide, flow cytometry (cell cycle analysis ROS: - H2DCFDA assay, flow cytometry (detection of ROS-positive cells) In addition to the effects which where induced by the plasma sources, the influence of the plasma treatment regime (direct, indirect and direct with medium exchange), the working gas (argon, air) and the surrounding liquids (cell culture medium: RPMI, IMDM; buffer solutions: HBSS, PBS) on the extent of the plasma cell effects were investigated. All plasma sources induced treatment time-dependent effects in HaCaT keratinocytes and melanoma cells (MV3): - loss of viable cells and reduced proliferation - induction of apoptosis after the longest treatment times - DNA damage 1 h after plasma treatment, 24 h after plasma treatment DNA damage was present only after the longest treatment times, evidence for DNA damage repair - due to accumulation of cells in G2/M phase, cell count in G1 phase (24 h) is lower - increase of ROS-positive cells 1 h and 24 h after plasma treatment It was shown that cells which were cultured in RPMI showed stronger effects (stronger loss of viability and more DNA damage) than cells which were cultured in IMDM. Also plasma-treated buffer solutions (HBSS, PBS) induced DNA damage in HaCaT cells. Direct and indirect plasma treatment caused almost the same effects. A subsequent culture medium exchange diminished the measured effects. It seems to be that next to the kind of liquids and the plasma treatment time the incubation period of the cells with the plasma-treated liquid plays an important role. The plasma-generated reactive species can react with the water molecules and the organic compounds of the culture medium and create long living species (e.g. H2O2) which can interact with the cellular molecules. The other plasma components such as UV light and electric and magnetic fields seem to play only a secondary role in the plasma-cell interaction, because these components come only in contact with the cells during direct plasma treatment and cannot cause the strong effects seen after indirect plasma treatment. The surface DBD used in these studies was applied with air or argon. Argon-generated plasma induced effects on a lower level compared to air plasma effects. Air plasma comprises ROS and RNS in the gas phase. RNS are missing in argon plasma and can therefore not interact with the cells. In addition to the keratinocytes human melanoma cells were treated with the surface DBD (air). Compared to HaCaT cells reduced plasma treatment times resulted in biologically equivalent effects in melanoma cells. The test methods used here are suitable for the biological characterization of new plasma sources or for analyzing plasma-cell interaction of further cell lines. Further investigations should follow e.g. the specification of the plasma induced oxidative DNA damage and the resulting repair mechanisms.

Download full text files

Export metadata

Additional Services

Share in Twitter Search Google Scholar
Metadaten
Author: Susanne Straßenburg
URN:urn:nbn:de:gbv:9-001936-8
Title Additional (English):Influence of physical plasma on in vitro cultivated cells
Advisor:Prof. Dr. Ulrike Lindequist
Document Type:Doctoral Thesis
Language:German
Date of Publication (online):2014/06/25
Granting Institution:Ernst-Moritz-Arndt-Universität, Mathematisch-Naturwissenschaftliche Fakultät (bis 31.05.2018)
Date of final exam:2014/06/02
Release Date:2014/06/25
GND Keyword:Keratinozyt, Plasma
Faculties:Mathematisch-Naturwissenschaftliche Fakultät / Institut für Pharmazie
DDC class:500 Naturwissenschaften und Mathematik / 540 Chemie