Bitte verwenden Sie diesen Link, wenn Sie dieses Dokument zitieren oder verlinken wollen: https://nbn-resolving.org/urn:nbn:de:gbv:9-001926-3

Investigations on enantioselectivity and thermostability of carboxylesterases by means of protein engineering

  • In this thesis several methods of protein engineering were applied to explore and increase enantioselectivity and thermostability of certain carboxylesterases and to better understand the relationship between sequence, structure and function. For example, we were able to confirm the observed conservation of motifs like GX/GGGX and GXSXG, which was reported earlier. Yet, even more details were revealed and some were designated in numbers. However, the numbers may vary when even more sequences will be available, but the trend should remain the same. The power of the ABHDB lies in the information available throughout the very diverse and quite large superfamily. Structural equal positions can be easily compared and analysed regarding mutations, correlated mutations, prevalence etc., and visualization is simplified through direct output with YASARA software. The ABHDB was the first structural alignment of such a large number of known enzymes of the alpha/beta-hydrolase fold superfamily. With methods of rational protein engineering we were able to show that there is little flexibility of the GGG(A)X motif for the eukaryotic enzyme PLE 1 and the natural motif appears to be a good solution for high activity and enantioselectivity of PLE 1 in the conversion of tertiary alcohol esters. In a focused directed evolution approach, we were able to identify variants of BsteE with moderate, but significantly increased enantioselectivity in the kinetic resolution of tetrahydrofuran-3-yl acetate, and hence, were able to proof that the concept of ‘small but smart’ libraries is an efficient way to find improved mutants, while the screening effort was reduced. Moreover, we were able to show that the domain exchange enhanced the thermostability of BsubE, while expression level and activity were maintained or increased, respectively. Despite the great achievements and possibilities at present, we are not yet in the position to directly modify the gene to alter the structure in a complete predictable fashion to improve functional properties as imagined by Ulmer (1983). Nevertheless, substantial changes can be targeted and as demonstrated in this work, several broadly applicable methods are at hand. Furthermore, bioinformatics tools play an essential role in planning of experiments, analysis and interpretation.
  • In dieser Arbeit wurden verschiedene Methoden des Protein-Engineering angewendet, um die Enantioselektivität und Thermostabilität von Carboxylesterasen zu untersuchen und zu steigern. Ziel war es auch, den Zusammenhang zwischen Sequenz, Struktur und Funktion besser zu verstehen. Die meisten Enzyme dieser Enzymklasse weisen eine alpha/beta-Hydrolasefaltung auf, welche in Artikel I eingehend beschrieben wurde. Mit Hilfe der 3DM-Software wurde ein Struktur-basiertes Sequenzalignment (hier auch als Datenbank bezeichnet) erstellt, das mehr als 12,000 Sequenzen der Superfamilie der Proteine mit alpha/beta Hydrolasefaltung enthält und eine Fülle an Informationen bietet. Bei der Analyse der Superfamilie wurden bekannte Schlüsselmotive wiedergefunden und bestätigt. In den verschiedenen Unterfamilien konnten verschiedene Konservierungsmuster festgestellt und Häufigkeiten analysiert werden. Des Weiteren kann mit Hilfe der Datenbank die Verbesserung von Proteinen mittels gerichteter Evolution gezielter durchgeführt werden, da vorwiegend Aminosäuren ausgewählt werden, die auch eine gewisse Häufigkeit in der „Natur“ bzw. der Gesamtheit der betrachteten Sequenzen besitzen. Dadurch kann der Screening-Aufwand zum Teil erheblich reduziert werden. Die meisten Enzyme mit alpha/beta-Hydrolasefaltung weisen entweder ein GX- oder GGG(A)X-Motiv auf. Diese Klassifizierung kann direkt Informationen über die Fähigkeit zur Umsetzung von Estern tertiärer Alkohole durch diese Enzyme geben, denn viele Enzyme mit GGG(A)X-Motiv können diese Ester hydrolysieren. Artikel II beschreibt den Austausch aller Glycin-Reste des GGG(A)X-Motivs des gamma–Isoenzyms der Schweineleberesterase (PLE 1) mit Alanin. Die sieben Mutanten und das Wildtyp-Enzym wurden in kinetischen Racematspaltungen mit drei Acetat-Estern tertiärer Alkohole eingesetzt. Hierbei konnte gezeigt werden, dass dieses Motiv nur einen relativ geringen Spielraum für Mutationen aufweist. Vor allem die Mutation des zentralen Glycins führte zu erheblichem Aktivitäts- und Selektivitätsverlust. Letztendlich stellte sich heraus, dass das natürliche Motiv ein Garant für hohe Aktivität und Enantioselektivität der PLE 1 gegenüber Estern tertiärer Alkohole ist. Bei der Mutagenese einer Esterase aus Bacillus stearothermophilus mittels fokussierter gerichteter Evolution (Artikel III) wurde die bereits erwähnte 3DM-Datenbank der Superfamilie der Proteine mit alpha/beta Hydrolasefaltung verwendet. Mittels molekularem Docking und Moleküldynamiksimulationen wurden zunächst vier verschiedene Zielaminosäuren im aktiven Zentrum der Esterase ausgewählt. Für diese vier Positionen wurden daraufhin die Aminosäure-Häufigkeiten innerhalb einer neuen Unterfamilie mit ca. 3300 Sequenzen in der Datenbank ermittelt. Daraus wurden Codons für die gezielte Mutagenese abgeleitet und zwei kleine Mutanten-Bibliotheken generiert. Es konnten mehrere Mutanten identifiziert werden, die eine signifikant erhöhte Enantioselektivität (E-Wert = 10) bei der kinetischen Racematspaltung von Tetrahydrofuran-3-ylacetat aufwiesen. Somit konnte hier die Anwendbarkeit des bereits bekannten Konzeptes „klein, aber fein“ („small, but smart“) belegt werden. Neben der Enantioselektivität ist die Thermostabilität ein weiterer Schlüsselfaktor für eine effektive Anwendung von Enzymen in industriellen Prozessen. Daher ist die Verbesserung dieser Eigenschaft häufiges Ziel von Protein-Engineering-Versuchen. Bei den Arbeiten zu Artikel IV wurden zunächst zwei sehr homologe Esterasen aus Bacillus stearothermophilus (BsteE) bzw. Bacillus subtilis (BsubE) verglichen. An 63 Aminosäurepositionen weisen sie unterschiedliche Aminosäure-Seitenketten auf. Zudem unterscheiden sie sich in ihrer Thermoaktivität und Thermostabilität. BsteE ist moderat thermostabil, wohingegen BsubE mesophil ist. Mittels B-Fitter-Analyse konnten verschiedene Mutationen ermittelt werden, die womöglich für die höhere Stabilität der BsteE verantwortlich sind. Etliche dieser Aminosäuren befinden sich innerhalb einer Region der Esterase. Daher wurde ein Gen-Abschnitt codierend für 30 Aminosäuren aus dem Gen der BsteE herausamplifiziert und mittels einer speziellen Polymerasekettenreaktion in das Gen der BsubE eingefügt. Durch diesen Domänen-Austausch konnte die Thermostabilität um 4°C erhöht werden. Hierbei wurde das Expressionslevel nicht beeinflusst und die Aktivität sogar verbessert. Mittels weiterer Punktmutationen konnte ein Gesamtunterschied der Thermostabilität von 11°C im Vergleich zum Wildtypenzym von Bacillus subtilis erreicht werden. Diese zusätzlichen Mutationen führten jedoch gleichzeitig zu einer eingeschränkten Aktivität. Trotz der enormen Fortschritte und Möglichkeiten im Bereich des Protein-Engineering, ist es bisher noch nicht möglich, rekombinante Gene so zu modifizieren, dass sich Struktur und Funktion der Proteine komplett vorhersagbar verändern lassen, dennoch lassen sich bereits wesentliche Verbesserungen mit Hilfe der vielfältigen Methoden erreichen.

Download full text files

Export metadata

Additional Services

Share in Twitter Search Google Scholar
Metadaten
Author: Markus Georg Gall
URN:urn:nbn:de:gbv:9-001926-3
Title Additional (German):Untersuchungen zur Enantioselektivität und Thermostabilität von Carboxylesterasen mittels Protein Engineering
Advisor:Prof. Dr. Uwe Bornscheuer
Document Type:Doctoral Thesis
Language:English
Date of Publication (online):2014/06/27
Granting Institution:Ernst-Moritz-Arndt-Universität, Mathematisch-Naturwissenschaftliche Fakultät (bis 31.05.2018)
Date of final exam:2014/05/16
Release Date:2014/06/27
GND Keyword:Biokatalyse, Enantioselektivität, Esterasen, Proteindesign, Temperaturbeständigkeit
Faculties:Mathematisch-Naturwissenschaftliche Fakultät / Institut für Chemie und Biochemie
DDC class:500 Naturwissenschaften und Mathematik / 540 Chemie