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Development of novel Surface Plasmon Resonance-based biosensors with purified recombinant human HER-2 and progesterone receptor produced in two different yeast species

  • The following work is describing the development of two innovative biosensors for the detection of biologically relevant molecules in the field of ecology and medical diagnostics. Biosensors have the particularity to possess a biological partner which recognizes the target molecule and a physical detection method responsible for the transformation of this biological interaction into measurable information. In the present case, both biosensors are designed following the same strategy and use a recombinant produced human receptor as biological partner and the surface plasmon resonance (SPR) technique to transform the biological interaction in quantitative information. The progesterone biosensor is aimed to detect and quantify substances with affinity to the human progesterone receptor. The recent discoveries that some chemicals present in low quantities in the ecosystem called endocrine disrupting chemicals (EDCs) have a negative impact on the aquatic life fitness raised concerns about the effects of these same molecules to the human health. In order to assess the effects of these EDCs, the use of classical analytical detection methods like high performance liquid chromatography (HPLC) or gas chromatography (GC) is not sufficient as these techniques only quantify a defined molecule without giving information about its biological activity. By integrating a recombinant human progesterone receptor, the progesterone biosensor can determine the biological activity of an unknown molecule or of a mixture of molecules in a real sample. In this work, two different yeasts – one methylotrophic (Hansenula polymorpha) and one non-methylotrophic (Arxula adeninivorans) - were selected as host for the recombinant protein production and their performances were compared. Different purification strategies were assayed and the binding activity of the purified progesterone receptor was then confirmed by enzyme like receptor assay (ELRA) and SPR. This led to the design of a first version of the biosensor with the immobilization of a progesterone-BSA ligand to the surface of a SPR chip and the use of a progesterone receptor mixed with the target molecule as sample. This competitive assay format was successfully utilized with a commercial progesterone-BSA ligand as target molecule and the next step will be the adaptation of this biosensor for real samples measurements. The HER-2 biosensor was developed as an answer for one of the most critical issue in the field of breast cancer diagnostics. In approximately 30 % of cancer cases, the transmembrane protein HER-2 can be found in large amount at the surface of the carcinoma cells and these cases are known to be particularly aggressive. Based on the amount of HER-2 protein at the surface of the cells, the pathologists established a scale with four levels to adapt the treatment to each patient. Although effective therapies have been developed to treat the HER-2 positive breast cancer, one of the major challenges remains the classification of breast sample in this scale as the only accepted determination methods are immunohistochemistry (IHC) and fluorescent in situ hybridization (FISH) which are only qualitative. In this work, a biosensor has been designed to quantify the amount of the HER-2 protein in a crude cell extract from a breast cancer tissue sample. To achieve this, the strategy is to utilize an antibody specifically targeted against the HER-2 protein and bound to a SPR chip. As the development of this biosensor necessitated the use of large amount of purified HER-2 protein, it was decided to produce recombinant full-length HER-2 in two different yeasts and to purify it by chromatography. This recombinant protein production required particular attention due to the membrane localization of HER-2. The structural integrity of the recombinant protein was confirmed by Western Blot and ELISA and different antibodies were bound to SPR chips in order to detect the HER-2 protein. After finding the conditions giving an optimal SPR signal, a protocol was developed to extract native HER-2 from breast tissue sample and the biosensor was assayed with this crude cell extract.
  • Die folgende Arbeit beschreibt die Entwicklung von zwei innovativen Biosensoren für die Detektion von biologisch relevanten Molekülen im Bereich der Ökologie und der medizinischen Diagnostik. Beide Biosensoren sind mit biologischen Komponenten zur Erkennung eines Zielmoleküls und einen Transducer, der die Wechselwirkung zwischen biologischer Komponente und Zielmolekül mittels physikalischer Detektionsmethode in ein messbares Signal umwandeln kann, ausgerüstet. Als biologische Komponenten enthalten sie ein rekombinantes humanes Protein, während als Detektionsmethode die Surface Plasmon Resonanz (SPR) Technik angewandt wird. Ziel des ersten Biosensors, den Progesteron-Biosensor, ist die Erkennung und Quantifizierung von Substanzen mit Affinitäten zum humanen Progesteron-Rezeptor. Umfangreiche Studien haben bisher gezeigt, dass zahlreiche Chemikalien als sog. endokrine Disruptoren einen negativen Einfluss auf die Umwelt bzw. auf die menschliche Gesundheit haben, da sie eine hohe Affinität zum entsprechenden Hormon-Rezeptor aufweisen. Um den Einfluss dieser endokrinen Disruptoren einzuschätzen, ist die Verwendung von klassischen analytischen Detektionsmethoden wie der Hochleistungsflüssigkeitschromatographie (HPLC) oder Gaschromatographie (GC) nicht ausreichend, da diese Techniken nur bekannte Substanzen messen, ohne Informationen über deren biologische Aktivität zu erhalten. Durch erstmalige Nutzung eines rekombinant humanen Progesteron-Rezeptors als Biokomponente kann der Progesteron-Assay die biologische Aktivität einer unbekannten Substanz bzw. einer Mischung aus verschiedenen Substanzen in einer Realprobe bestimmen. Im Rahmen dieser Arbeit wurden zwei verschiedene Hefearten - Hansenula polymorpha (eine methylotrophe Hefe) und Arxula adeninivorans (eine dimorphe Hefe) - als Wirtsorganismen für die Synthese des rekombinanten humanen Progesteron-Rezeptors ausgewählt und ihre Leistungsfähigkeit bezüglich maximaler Rezeptor-Akkumulation verglichen. Zusätzlich wurde die Reinigungsprozedur des rekombinanten Rezeptors optimiert und dessen spezifische Affinität gegenüber Progesteron per Rezeptorassay (ELRA) und SPR ermittelt. Abschließend konnte ein erster Biosensor mit Progesteron-BSA Ligand funktionalisierten SPR-Chips und einem Mix aus Progesteron-Rezeptor und Zielmolekül als Messprobe etabliert werden. Der zweite auf HER-2 basierende Biosensor wurde als Tool für die Brustkrebsdiagnostik entwickelt. So weisen etwa 30 % aller Brustkrebs-Patienten eine Überexpression des HER-2-Gens auf, dessen Genprodukt als Transmembranprotein in hohen Konzentrationen an der Zell-Oberfläche akkumuliert wird. Diese Fälle sind eine besonders aggressive Art des Brustkrebses. Basierend auf der Konzentration des HER-2-Proteins an der Zelloberfläche wird in der Pathologie zur Diagnostik dieses Typs von Brustkrebs eine vier Scores umfassende Skala als Entscheidungshilfe für die individuelle Behandlung eines jeden Patienten genutzt. Obwohl bereits heute wirksame Therapien zur erfolgreichen Behandlung von HER-2 positiven Brustkrebs verfügbar sind, bleibt die Klassifizierung der Brustkrebs-Gewebeprobe mit Hilfe dieser Skala eine Herausforderung. Zurzeit sind Immunohistochemie (IHC) und Fluorescence in situ Hybridization (FISH) die einzigen akzeptierten Entscheidungsmethoden. Aus diesem Grund wurde im Rahmen dieser Dissertationsarbeit ein Biosensor designt, mit dem sich die Konzentration an HER-2-Proteinen in Brustkrebs-Gewebeproben detektieren lässt. Dazu wurde ein SPR-Chip mit einem Anti-HER-2-Antikörper funktionalisiert. Da hierzu gereinigtes HER-2 Protein als Kontrolle benötigt wurde, wurde dieses Proteine als rekombinantes Protein in vollständiger Länge in zwei verschiedenen Hefen synthetisiert und per chromatographischen Verfahren gereinigt. Eine wesentliche Herausforderung dieser Prozedur war die Solubilisierung der membran-lokalisierten HER-2-Proteine. Die strukturelle Vollständigkeit des rekombinanten Proteins wurde per Western-Blot und ELISA bestätigt und mit Anti-HER2-Antikörpern funktionalisierten SPR-Chips deren Funktionstüchtigkeit detektiert. Nach Optimierung der SPR-Methode wurde ein Protokoll zur Extraktion von nativem HER-2 aus Brustgewebeproben erstellt und diese Zellextrakte in Kombination mit den HER-2 Kontrollproteinen für erste Biosensortests eingesetzt.

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Metadaten
Author: Alexandre Chamas
URN:urn:nbn:de:gbv:9-002273-5
Title Additional (German):Entwicklung innovativen Surface Plasmon Resonnanz-basierter Biosensoren mit gereinigten rekombinanten humanen HER-2 und Progesteron Rezeptor in zwei verschiedenen Hefearten hergestellt
Advisor:Prof. Dr. Rüdiger Bode
Document Type:Doctoral Thesis
Language:English
Date of Publication (online):2015/07/07
Granting Institution:Ernst-Moritz-Arndt-Universität, Mathematisch-Naturwissenschaftliche Fakultät (bis 31.05.2018)
Date of final exam:2015/03/27
Release Date:2015/07/07
GND Keyword:Brustkrebs, Hefeartige Pilze, Oberflächenplasmonresonanz, Progesteron
Faculties:Mathematisch-Naturwissenschaftliche Fakultät / Abteilung für Mikrobiologie und Molekularbiologie
DDC class:500 Naturwissenschaften und Mathematik / 570 Biowissenschaften; Biologie