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Functional and molecular characterization of T cells and natural killer (NK) cells in rainbow trout (Oncorhynchus mykiss)

  • The immune system of all vertebrates primarily is responsible to maintain the organisms homeostasis by either eliminating neoplastic or altered body cells and to protect against foreign invaders (viruses, bacteria, fungi, parasites) (Murphy 2012). It is a highly regulated network of innate and adaptive mechanisms between humoral factors and leukocytes. The successful elimination or protection is crucially based on differentiation of self from non-self. Pathogens and altered body cells are recognized by different receptor complexes on immune cells. Expressed pathogen- or danger-associated molecular patterns (PAMPs or DAMPs, respectively) are bound by pattern recognition receptors (PRR) (Takeuchi and Akira 2010). Missing major histocompatibility (MHC) class I molecules or non-self (e.g. allogeneic or xenogeneic cells) MHC are recognized by natural killer cell receptors (Fischer, Koppang and Nakanishi 2013, Raulet 2006). Foreign non-self peptides are presented through MHC class I (intracellular) or through MHC class II (extracellular) to B- cell or T cell receptor complexes. This initial activation is regulated by humoral factors or cellular interactions (receptor-ligand interactions) resulting in the activation, proliferation and effector function within an immune response. Some of the cellular receptors are permanently expressed on all leukocytes on a high level (MHC class I), whereas others only are expressed during certain developmental or activation stages or on certain leukocyte populations (monocytes, granulocytes, NK cells, lymphocytes) (Murphy 2012, Biosciences 2010). For different mammals (man, mouse, rat, but also swine, cattle, dog), a system of characterized leukocyte surface molecules primarily based on the recognition of these molecules by specific monoclonal antibodies (mabs) was summarized at international workshops as clusters of differentiation (CD) (Cobbold and Metcalfe 1994, Hopkins, Ross and Dutia 1993, Haverson et al. 2001, Mason et al. 2001). Using these mabs, it is not only possible to characterize the developmental and functional stage of different leukocyte subpopulations but also to define the interactions between these populations. For bony fish, such a system does not exist. Only a limited number of mabs against leukocyte surface molecules is available and most of them are strongly specific for species (Köllner et al. 2004, Köllner et al. 2001, Zhang et al. 2010, Ramirez-Gomez et al. 2012, Wen et al. 2011, DeLuca, Wilson and Warr 1983, Toda et al. 2011, Toda et al. 2009, Takizawa et al. 2011a, Hetland et al. 2010, Araki et al. 2008). The goal of this PhD work, therefore, was to develop monoclonal antibodies against surface markers of rainbow trout (Oncorhynchus mykiss) T cell population (chapter 2). The lymphocytes are characterized by the expression of a T cell receptor complex composed of TCR chains (α and β) and CD3 chains (α, β, γ, δ, ε and ζ). Cytotoxic T lymphocytes (CTLs) binds to MHC class I bound peptide on the infected host cell using their T cell receptor (TCR) and its co-receptor CD8 resulting in specific killing. Th cells recognize peptides through their T cell receptor (TCR) and their co-receptor CD4 after extracellular antigens uptake, processing and presentation via MHC class II by professional antigen presenting cells (macrophages, dendritic cells and B cells). During recent years, genes encoding MHC class I and II, TCR and their co-receptors CD8 and CD4 have been cloned in several fish species and antibodies have been developed to study protein expression in morphological and functional contexts. However, mabs specific for TCR or CD3 have not been established yet. Therefore, using pan-T cell marker specific mabs, the activation and kinetics of T cell subpopulation should be investigated (chapter 2). Moreover, a flow cytometry method was established using different lineage marker specific mabs to measure different leukocyte populations and their involvement in immune mechanisms of trout using a single tube assay (chapter 3). The first line of defense against altered body cells or pathogens is provided by evolutionarily ancient macrophages and natural killer (NK) cells. These innate mechanisms are well developed in bony fish. Two types of NK cell homologues have been described in fish: non-specific cytotoxic cells and NK-like cells (Shen et al. 2002, Shen et al. 2003, Shen et al. 2004, Fischer et al. 2013). Functional assays for innate and adaptive lymphocyte responses have been developed in only a few fish species. However, there are no tools available until now in trout to follow these cells directly in the immune response. The molecular characteristics and the expression on leukocyte subpopulations of CD56 were therefore analyzed. Furthermore, a mab that is specific for a molecule expressed only in NK cells but with uncommon expression kinetics was established (chapter 4). Overall, the established tools and methods allow a more detailed characterization of cellular immune mechanisms against intracellular pathogens in rainbow trout.
  • Das Immunsystem aller Vertebraten ist verantwortlich dafür, die Homöostase des Organismus, über die Eliminierung entarteter oder gealterter Körperzellen und durch den Schutz vor Infektionen (Viren, Bakterien, Pilze, Parasiten) (Murphy et al., 2012) aufrecht zu erhalten. Es ist ein komplex reguliertes Netzwerk angeborener und erworbener Immunmechanismen bei denen humorale Faktoren und zelluläre Effektoren interagieren. Diese Immunmechanismen basieren auf einer Unterscheidung zwischen “Eigen” und “Fremd” Strukturen. Pathogene oder veränderte Körperzellen werden darüber von verschiedenen Rezeptorkomplexen auf Immunzellen erkannt. Muster erkennende Rezeptoren (pattern recognition receptors, PRR) binden dabei an evolutionär konservierte Strukturen auf Pathogenen (pathogen associated molecular patterns, PAMP) oder mit einer Gewebszerstörung verbundenen Zellmarker (danger associated molecular patterns, DAMP) (Takeuchi and Akira 2010). Fehlende MHC I Moleküle (major histocompatibility class I) werden von Rezeptoren auf natürlichen Killerzellen erkannt (Fischer, Koppang and Nakanishi 2013, Raulet 2006). Fremdpeptide werden in eigenen MHC I bzw. MHC II Molekülen an B bzw. T-zellen präsentiert und von spezifischen Rezeptorkomplexen erkannt (BCR; TCR). Diese Aktivierung führt zu einer Proliferation und Reifung der B- bzw. T-Lymphozyten bis zu Effektorstadien Einige zelluläre Rezeptoren sind auf allen Leukozyten permanent exprimiert (z.B. MHC I), andere nur in bestimmten Reifungs- und Funktionsstadien bzw. auf bestimmten Leukozytenpopulationen. (Monozyten, Granulozyten, NK-Zellen, Lymphozyten) (Murphy et al., 2012). Basierend spezifischen monoklonalen Antikörpern, die spezifisch solche Moleküle binden wurde für verschiedene Säuger (Mensch, Maus, Ratte, Schwein, Rind, Hund) eine System von Differenzierungsmarkern (Cluster of Differentiation Molecules, CD) auf Leukozyten etabliert (Cobbold and Metcalfe 1994, Hopkins, Ross and Dutia 1993, Haverson et al. 2001, Mason et al. 2001). Mit diesen mAk ist es nicht nur möglich Entwicklungs- und Funktionsstadien einzelner Leukozytensubpopulationen zu bestimmen sondern auch die Interaktion solcher Populationen zu untersuchen. Für Knochenfisch existiert ein solches System nicht. Nur eine kleine Anzahl von mAk gegen Leukozytenmarker ist bisher publiziert (Köllner et al. 2004, Köllner et al. 2001, Zhang et al. 2010, Ramirez-Gomez et al. 2012, Wen et al. 2011, DeLuca, Wilson and Warr 1983, Toda et al. 2011, Toda et al. 2009, Takizawa et al. 2011a, Hetland et al. 2010, Araki et al. 2008). Die meisten von diesen mAk sind zudem strikt Spezies spezifisch. Ziel der vorliegenden Arbeit war es daher, solche mAk spezifisch für T-Zellpopulationen der Regenbogenforelle (Oncorhynchus mykiss) zu entwickeln (Kapitel 2). T-Lymphozyten sind durch die Expression eines T-Zell-Rezeptorkomplexes charakterisiert, der aus verschiedenen Ketten des (α α, δ β) und dem CD3 Molekül mit α, β, γ, δ, ε und ζ) Ketten gebildet wird. Zytotoxische T-Zellen binden an MHC I präsentierte Fremdpeptide über diesen TCR Komplex und dem Ko-Rezeptormolekül CD8. T-Helfer-Zellen erkennen MHC II präsentierte Fremdpeptide über den TCR Komplex und dem Ko-Rezeptor CD4. In den letzten Jahren sind die Gene, die für solche Moleküle kodieren, bei verschiedenen Fischarten kloniert und sequenziert worden. Spezifische mAk gegen diese Moleküle z.B. im Goldfisch halfen deren Expression auf Leukozyten in morphologischem und funktionellen Kontext zu charakterisieren Mak spezifisch für den TCR Komplex konnten bisher nicht etabliert werden. Mit den in dieser Arbeit charakterisierten anti-pan-T-Zell mAk konnte die Organverteilung sowie die Aktivierung von T-Zellen in der Regenbogenforelle erstmalig beschrieben werden (Kapitel 2). Darüber hinaus wurde eine Methode etabliert, bei der durch Kombination verschiedener mAk spezifisch für Differenzierungsmarker die Verteilung und Reaktionskinetik von Leukozytensubpopulationen untersucht werden kann (Kapitel 3). Die erste Verteidigungslinie gegen Pathogene wird durch die evolutionär alten Monozyten und NK-Zellen gebildet. Diese angeborenen Immunmechanismen sind hoch entwickelt in Knochenfischen. Zwei Subpopulationen von NK-Zellen wurden in Fischen bisher beschrieben: natürliche zytotoxische Zellen und NK-Zellen (Shen et al. 2002, Shen et al. 2003, Shen et al. 2004, Fischer et al. 2013). Funktionstest zur Charakterisierung von angeborenen und erworbenen zellulären Immunmechanismen sind bisher nur in wenigen Fischarten etabliert worden, ohne das jedoch spezifische mAk vorhanden sind, um diese Zellen direkt zu messen. Daher wurde hier das ein NK-Zelle Marker CD56 molekular charakterisiert und die Expression auf verschiedenen Leukozytenpopulationen untersucht (Kapitel 4). Die hier etablierten mAk sowie die Funktionstest erlauben zukünftig eine detaillierte Untersuchung angeborener und erworbener zellulärer Immunmechnismen in der Regebogenforelle.

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Metadaten
Author: Dang Thi Huong
URN:urn:nbn:de:gbv:9-002318-5
Title Additional (German):Funktionelle und molekulare Charakterisierung von T-Zellen und natürliche Killerzellen (NK) in der Regenbogenforelle (Oncorhynchus mykiss)
Advisor:Prof. Dr. Dr. h.c. Thomas C. Mettenleiter, Dr. Bernd Köllner
Document Type:Doctoral Thesis
Language:English
Date of Publication (online):2015/10/01
Granting Institution:Ernst-Moritz-Arndt-Universität, Mathematisch-Naturwissenschaftliche Fakultät (bis 31.05.2018)
Date of final exam:2015/09/29
Release Date:2015/10/01
Tag:CD56, Rainbow Trout, T cell, antibody, diversity
GND Keyword:Antikörper, CD56, Regenbogenforelle, T zell, Vielfalt
Faculties:Mathematisch-Naturwissenschaftliche Fakultät / Abteilung für Mikrobiologie und Molekularbiologie
DDC class:500 Naturwissenschaften und Mathematik / 570 Biowissenschaften; Biologie