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Biotransformation von Flavonoiden

  • Neben verschiedenen gesundheitsfördernden Eigenschaften hat das Flavonoid Phloretin eine süßkraftverstärkende Wirkung. Es ist nicht nur in der Pharma- und Kosmetikindustrie, sondern auch als Aromastoff für die Lebensmittelproduktion von Interesse. Bislang gab es kein vielversprechendes, biotechnologisches System zur Herstellung von Phloretin. Die Extraktion aus Pflanzen führt aufgrund niedriger und schwankender Konzentrationen zu einer schlechten Verfügbarkeit. Chemisch synthetisiertes Phloretin hingegen kann aufgrund der „Europäischen Aromenverordnung“ nicht als „natürlicher Aromastoff“ deklariert werden. Daher ist Phloretin als „natürlicher Aromastoff“ relativ teuer und für die Aromenindustrie kaum nutzbar. Ziel dieser Arbeit war es, einen effizienten Weg zur biotechnologischen Produktion von Phloretin zu finden. Als Substrat sollte bevorzugt Naringenin eingesetzt werden. Obwohl ähnliche Reaktionswege in der Literatur beschrieben wurden, konnte mit ausgewählten filamentösen Pilzen in Ganzzellbiokatalysen keine Phloretinbildung beobachtet werden. Es gibt jedoch auch Bakterien, die in der Lage sind, die Zielreaktion auszuführen. Da es sich hierbei ausschließlich um obligate Anaerobier handelt, eignen sich diese Stämme kaum für die biotechnologische Produktion von Phloretin. Außerdem erfolgt in diesen Bakterien die Zielreaktion als Teil des Naringeninabbaus, das entstehende Phloretin wird abgebaut. Über die Zielreaktion im anaeroben Bakterium Eubacterium ramulus lagen bereits Informationen aus anderen Forschungsarbeiten vor, darunter auch ein Sequenzfragment vom N-Terminus der Chalconisomerase (CHI). Die CHI katalysiert die Isomerisierung von Naringenin zu Naringeninchalcon. Aus der Literatur ging hervor, dass E. ramulus die Zielreaktion von Naringenin über Naringeninchalcon zum Phloretin durchführen kann, aber dass außer der CHI ein weiteres Enzym beteiligt ist. Das genetische Potential von E. ramulus sollte genutzt werden, um einen rekombinanten Mikroorganismus zu generieren. Nach der Sequenzierung des Genoms von E. ramulus konnte die N-terminale Sequenz in der vorliegenden Arbeit genutzt werden, um in silico das Gen der CHI zu identifizieren. Da vermutet wurde, dass für die Reduktion von Naringeninchalcon zu Phloretin eine Enoatreduktase (ERED) verantwortlich ist, wurde über eine BLAST-Analyse ein konserviertes Motiv für Enoatreduktasen ermittelt, mit dem im Genom von E. ramulus das Gen einer ERED in silico identifiziert wurde. Die Gene wurden anschließend in E. coli kloniert. Für die CHI konnte eine sehr gute Überexpression und enzymatische Aktivität in zellfreien Biokatalysen nachgewiesen werden. Der Aktivitätsnachweis ermöglichte auch die Aufreinigung der CHI aus dem Proteinrohextrakt. In der Diplomarbeit von M. Thomsen wurde die Aufreinigung optimiert. Der Aufreinigungsprozess beinhaltete eine Anionenaustauschchromatographie, hydrophobe Interaktionschromatographie und Gelfiltration und führte zu einer sehr hohen Reinheit der CHI. Das aufgereinigte Enzym wurde anschließend biochemisch charakterisiert. Außerdem wurden mit dem rekombinanten Stamm (mit Genen für CHI und ERED) Versuche im Ganzzellsystem mit Naringenin durchgeführt. Dabei wurde festgestellt, dass die Reaktion zum Zielprodukt Phloretin empfindlich gegenüber Sauerstoff ist. Unter anaerober Atmosphäre konnte in diesem System eine höhere Phloretinbildung beobachtet werden. Da die CHI in vorherigen Untersuchungen keine Sensitivität gegenüber Sauerstoff gezeigt hatte, wurden in der Diplomarbeit von C. Peters Expression und Aktivität der ERED unter diesem Aspekt näher untersucht. Es konnte festgestellt werden, dass die Expression der ERED unter anaeroben Bedingungen erfolgen sollte, das Enzym ist jedoch auch unter Anwesenheit von Sauerstoff aktiv. Die in der Literatur beschriebenen Ansätze zur Entwicklung von biotechnologischen Verfahren zur Phloretinproduktion basieren vor allem auf dem Einsatz pflanzlicher Gene und führten bisher nur zu geringen Produktkonzentrationen. In der vorliegenden Arbeit ist es gelungen, ein neues System zur biotechnologischen Produktion von Phloretin zu entwickeln, mit dem eine höhere Ausbeute erzielt werden kann. Basierend auf den neu identifizierten Genen aus E. ramulus, die erfolgreich in E. coli exprimiert wurden, wird das Problem der rekombinanten Expression eukaryotischer Gene in Prokaryoten umgangen. Im Vergleich zu E. ramulus ist E. coli in der Biotechnologie bereits etabliert und relativ unempfindlich gegenüber Sauerstoff. Außerdem findet der Phloretinabbau, wie er in E. ramulus und in verwandten Bakterien ablaufen würde, in E. coli nicht statt. In dieser Arbeit wurde gezeigt, dass es für die Weiterentwicklung der industriellen Biotechnologie vorteilhaft ist, das enorme Potential des bakteriellen Stoffwechsels durch Gentechnik nutzbar zu machen. Durch diese Strategie wird „nachhaltige Biokatalyse auf neuen Wegen“ in der Flavonoidbiotechnologie ermöglicht.
  • In addition to various health benefits, the flavonoid phloretin has a sweet enhancing effect. Therefore, it is not only of interest in the pharmaceutical and cosmetic industries, but also as a flavoring agent for the production of beverages and sugar-reduced foods. So far, there was no promising, biotechnological system for the production of phloretin. The extraction from plants results in poor availability due to low, fluctuating concentrations. Chemical synthesized Phloretin can not be declared as "natural flavor" due to European decrees. Therefore phloretin as "natural flavor" is expensive and so far barely usable for the flavor industry. The aim of this study was to find an efficient way for the biotechnological production of phloretin. The flavanone naringenin should be preferably used as substrate. Although similar pathways are described, the production of phloretin with selected strains of mold in whole-cell-catalysis was not observed . However, there are also bacteria that are able to carry out the target reaction. Though, they are not suitable for biotechnological production: The described bacteria are fastidious anaerobes and thus difficult to handle. Moreover, they carry out the target reaction as part of Naringenin degradation, the resulting phloretin is degraded in further reactions. Some information about the target reaction in the anaerobic bacterium Eubacterium ramulus was already available from other research, including the sequence of a N-terminal fragment of the chalcone isomerase (CHI). CHI catalyzes the isomerization of naringenin to naringenin chalcone, however, the equilibrium of this reaction lies on the side of naringenin. In the literature it was described that E. ramulus can perform the target reaction of naringenin to phloretin over naringenin chalcone, but that in addition to CHI another enzyme is involved. The genetic potential of E. ramulus was meant to be used to generate a recombinant microorganism. After sequencing of the genome of E. ramulus, the N-terminal sequence of CHI could be used in this thesis to identify in silico the gene for this enzyme. It has been assumed that the remaining reduction of naringenin chalcone to phloretin is catalysed by an enoate reductase (ERED). A BLAST analysis was used to identify a conserved motif for ERED. This way an ERED gene was identified in the genome of E. ramulus in silico. The genes were then cloned into E. coli. For the CHI both a very good overexpression, and enzymatic activity in cell-free biocatalysis against naringenin chalcone could be detected. The detection of activity enabled the selective purification of CHI from crude protein. As part of the thesis of M. Thomsen the purification was optimized to enable precise enzymatic investigations. The purification included an anion exchange chromatography, hydrophobic interaction chromatography and gel filtration, yielding a very high purity of CHI. The purified CHI was biochemically characterized. The conversion of naringenin to naringenin chalcone could not be detected due to the reaction equilibrium. In studies on enantioselectivity it was found that CHI is enantioselective for the formation of (S)-naringenin - this corresponds to the enantioselectivity of CHI from plants. However, in most other aspects, the CHI is different from the plant enzymes since no direct relationship exists. In addition, cultivations in a whole-cell system with the substrate naringenin were carried out (with the two genes for CHI and ERED) with the recombinant strain. It was found that the reaction towards phloretin is sensitive to oxygen. Under anaerobic atmosphere significantly higher phloretin production was observed. Since the CHI was not sensitive to oxygen in previous studies, expression and activity of ERED were examined from this point in the thesis of C. Peters. It has been found that ERED should be expressed under anaerobic conditions, but the enzyme is also active in presence of oxygen. The approaches on the development of biotechnological processes for production of phloretin described in literature are based mainly on the use of plant genes and led so far only to low product concentrations. In the course of this work a new system for the biotechnological production of phloretin was developed, which can be used to achieve a higher yield. Based on the newly identified genes from E. ramulus that were successfully expressed in E. coli, the problem of recombinant expression of eukaryotic genes in prokaryotes is bypassed. Compared to E. ramulus E. coli is already established in biotechnology and is less sensitive to oxygen. Additionally, the degradation of phloretin will not take place in E. coli as it would proceed in E. ramulus and related bacteria. In this work it could be shown that it is advantageous for the development of sustainable industrial biotechnology to utilize the potential of bacterial metabolism by genetic engineering.

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Metadaten
Author: Mechthild Gall
URN:urn:nbn:de:gbv:9-002348-8
Title Additional (English):Biotransformation of flavonoids
Advisor:Prof. Dr. Uwe Bornscheuer
Document Type:Doctoral Thesis
Language:German
Date of Publication (online):2015/11/17
Granting Institution:Ernst-Moritz-Arndt-Universität, Mathematisch-Naturwissenschaftliche Fakultät (bis 31.05.2018)
Date of final exam:2015/06/02
Release Date:2015/11/17
Tag:Chalconisomerase, Eubacterium ramulus
Eubacterium ramulus, chalcone isomerase
GND Keyword:Enoatreduktase, Flavonoide, Naringenin, Phloretin
Faculties:Mathematisch-Naturwissenschaftliche Fakultät / Institut für Chemie und Biochemie
DDC class:500 Naturwissenschaften und Mathematik / 540 Chemie