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Calcium regulation in normal and dystrophin-deficient muscle and the role of TRP channels

  • All types of muscles use Ca2+ as their main intracellular messenger. In skeletal muscle fibers abnormal levels of intracellular calcium result in altered contractile properties, altered energy metabolism, and altered gene expression. Moreover, long term failure of normal Ca2+ homeostasis can lead to cell death of muscle fibers by necrosis and apoptosis. Elevations of intracellular Ca2+ levels are more and more regarded as the reason for pathological changes and muscle fiber damage in Duchenne Muscular Dystrophy (DMD). DMD is a severe recessive x-linked muscle disease caused by mutations in the dystrophin gene. The characteristics of DMD are muscle tissue wasting and fibrosis. Both muscle wasting and intracellular Ca2+ are to be reflected in changes of muscle force. Several Ca2+ conducting channels including transient receptor potential (TRP) channels are supposed to account for the abnormal Ca2+ homeostasis in DMD. Gene expressions of TRP channels have been studied in human and mouse skeletal muscle and among others TRPC3, TRPC6 and TRPV4 channels were found to occur in skeletal muscles. The present study followed the hypothesis that TRPC3, TRPC6 and TRPV4 are functional in skeletal muscle fibers and that they contribute to muscular Ca2+ homeostasis. Further, it was assumed that dysfunction of the mentioned TRP channels contributes to abnormal contractile properties and pathology and of dystrophin-deficient muscle. To study Ca2+ changes in mouse skeletal muscle fibers the fluorescent calcium indicator Fura-2 was used. Further, the technique of Mn2+ quench of Fura-2 fluorescence was applied. Muscle force measurements of mouse soleus and diaphragm strips were performed. To elucidate abnormalities of TRP channel function in dystrophin-deficient muscle, muscles and muscle fibers of mdx mice were studied. Hyperforin, an activator of TRPC6 channels elicited increases of calcium levels in wildtype muscle fibers. These increases were partly inhibited by the TRPC6 inhibitor 1-(5-chloronaphthalenesulfonyl) homopiperazine hydrochloride (ML-9). The TRPC3/TPRC6 activator 1-oleoyl-2-acetyl-sn-glycerol (OAG) resulted in increased calcium entry, which was attenuated by ML-9. 2-aminoethoxydiphenylborane (2-APB), an unspecific TRP channel inhibitor, suppressed calcium entry in muscle fibers under basal conditions. In addition, the specific TRPC3 inhibitor Pyr3, strongly inhibited background calcium entry. The TRPV4 activator 4α-phorbol 12,13-didecanoate (4α-PDD) induced significant increased calcium entry and this increase could be inhibited by the TRPV4 inhibitor HC 067047. During muscle force recordings ML-9 significantly inhibited twitches and tetani and accelerated muscle fatigue during sustained repetitive stimulation. The results indicate that TRPC3, TRPC6 and TRPV4 are functionally expressed in mouse muscle fibers. TRPC3 stays active under the basal conditions and contributes to background calcium entry. In contrast, TRPC6 and TRPV4 did not seem to be active at resting conditions, but could be pharmacologically activated. TRPC6 may play a role to counteract the calcium loss under long-term muscle fatigue. Though TRPC3 and C6 play a role for muscular Ca2+ homeostasis, it is unclear whether and how the two channels associate and cross-talk with each other in skeletal muscle cells. In mdx fibers Pyr3 inhibited background calcium influx stronger that in WT fibers, implying a possible over-activation of TRPC3 channels in mdx muscle fibers. At later stages mdx muscle showed marked decrease in force reflecting muscle wasting. Soleus showed moderate decrease and diaphragm showed severe decrease (more than 60%) in force. Resistance to muscle fatigue was shown in mdx soleus muscle when compared with WT soleus muscle. Diaphragm segments of mdx mice showed very strong resistance to muscle fatigue. The results indicate a substantial loss of muscle mass, an increase in oxidative fiber types and a reduction of fast fatigable muscle fibers. It is concluded that the hypothesis of functional expression of TRPC3, TRPC6 and TRPV4 in mouse skeletal muscle has been confirmed. The results give improved knowledge about the relation of Ca2+ homeostasis, mdx pathology and TRP channels. Diaphragms of old mdx mice show severe muscle weakness but the remaining fibers of the diaphragm showed strong fatigue-resistance. The application of a TRPC3 inhibitor may be a promising treatment to prevent high Ca2+ mediated muscle damage in muscular dystrophy.
  • Alle Arten von Muskeln verwenden Ca2+ als ihren wichtigsten intrazellulären Messenger. Abnorme Werte von intrazellulärem Calcium in Skelettmuskelfasern führen zu veränderten kontraktilen Eigenschaften, verändertem Energiestoffwechsel und veränderter Genexpression. Darüber hinaus kann langfristige Ausfall der Ca2+-Homöostase zum Zelltod der Muskelfasern durch Nekrose und Apoptose führen. Erhebungen der intrazellulären Ca2+-Ebenen gelten als der Grund für die pathologischen Veränderungen und Muskelfaserschäden bei der Duchenne-Muskeldystrophie (DMD). DMD ist eine schwere, rezessiv X-chromosomale Muskelerkrankung verursacht durch Mutationen im Dystrophin-Gen. Die Merkmale der DMD sind Muskelschwund, Gewebe und Fibrose. Sowohl Muskelschwund als auch intrazelluläres Ca2+ sollen sich in Veränderungen der Muskelkraft niederschlagen (widerspiegeln). Verschiedene Ca2+Känale, darunter die transient receptor potential (TRP)-Kanäle, werden für die anormale Calciumhomöostase bei der Duchenne-Muskeldystrophie verantwortlich gemacht. Genexpressionen der TRP-Kanäle wurden beim Menschen und Maus in Skelettmuskeln untersucht; unter anderem konnten TRPC3, TRPC6 und TRPV4 Kanäle in der Skelettmuskulatur nachgewiesen werden. Die vorliegende Studie verfolgt die Hypothese, dass TRPC3, TRPC6 und TRPV4 im Skelettmuskelfasern funktionsfähig sind und dass sie zur muskulären Ca2+-Homöostase beitragen. Weiterhin wurde davon ausgegangen, dass Dysfunktion der genannten TRP-Kanäle zu abnormen kontraktilen Eigenschaften und zur Pathologie des Dystrophin-defizienten Muskels beiträgt. Um dies zu untersuchen, wurden Ca2+Änderungen in Skelettmuskelfasern aus Maus mit Hilfe des fluoreszierenden Kalzium-Indikators Fura-2 verwendet. Darüber hinaus wurde die Technik des Mn2+Quenchings von Fura-2-Fluoreszenz angewendet. Muskelkraftmessungen an Soleus- und Zwerchfellstreifen der Maus wurden durchgeführt. Um Störungen der TRP-Kanal-Funktion im Dystrophin-defizienten Muskel nachweisen zu können, wurden Muskeln und Muskelfasern von MDX-Mäusen untersucht. Hyperforin, ein Aktivator der TRPC6-Kanäle, löst eine Erhöhungen von Kalziumspiegeln in Wildtyp-Muskelfasern aus. Diese Erhöhungen wurden teilweise durch den TRPC6-Inhibitor 1-(5-chloronaphthalenesulfonyl) Homopiperazin-hydrochlorid (ML-9) gehemmt. Der TRPC3/TPRC6-Aktivator 1-oleoyl-2-acetyl-sn-glycerol (OAG) führte zu erhöhtem Kalziumeinstrom, der von ML-9 abgeschwächt wurde. 2-Aminoethoxydiphenylboran (2-APB), ein unspezifischer TRP-Kanal-Hemmer, unterdrückte den Kalziumeinstrom in Muskelfasern unter basalen Bedingungen. Darüber hinaus hemmte der spezifische TRPC3-Inhibitor Pyr3 den basalen Calciumeinstrom. Der TRPV4-Aktivator 4α-Phorbol 12,13-Didecanoat (4α-PDD) induzierte einen signifikant erhöhten Kalziumeinstrom, und dieser Anstieg konnte durch den TRPV4-Inhibitor HC 067047 gehemmt werden. Bei Muskelkraftmessungen hemmte ML-9 deutlich h Zuckungen und Tetani und beschleunigte die Muskelermüdung während der repetitive Stimulation. Die Ergebnisse zeigen, dass TRPC3, TRPC6 und TRPV4 in Mausmuskelfasern funktionell exprimiert werden. TRPC3 bleibt unter basalen Bedingungen aktiv und trägt zum Hintergrund-Kalziumeinstrom bei. Im Gegensatz dazu scheinen TRPC6 und TRPV4 unter Ruhebedingungen nicht aktiv zu sein, konnten aber pharmakologisch aktiviert werden. TRPC6 kann eine Rolle spielen, um den Kalziumverlust im Rahmen von langfristiger Muskelermüdung entgegenzuwirken. Obwohl TRPC3 und C6 für die muskuläre Ca2+-Homöostase eine Rolle spielen, ist es unklar, ob und wie die beiden Kanäle assoziiert sind und sich in Skelettmuskelzellen gegenseitig beeinflussen. In MDX-Fasern hemmte Pyr3 den Hintergrund-Kalziumeinstrom stärker als in WT-Fasern. Das impliziert eine mögliche übermäßige Aktivierung von TRPC3 in MDX-Muskelfasern. In späteren (pathologischen) Stadien des MDX-Muskels zeigte sich eine deutliche Abnahme der Kraft. Das widerspiegelt Muskelschwund. Soleus zeigte eine moderate Verringerung und Zwerchfelle zeigten eine ausgeprägte Verringerung (mehr als 60 %) der Kraft. Beständigkeit gegen Ermüdung der Muskulatur zeigte sich in Soleus-Muskel der MDX-Maus im Vergleich zum WT-Soleus-Muskel. Zwerchfellsegmente von MDX-Mäusen zeigten sehr starken Widerstand gegen Ermüdung der Muskeln. Die Ergebnisse implizieren einen erheblichen Verlust von Muskelmasse, Zunahme der oxidativen Fasertypen und eine Reduzierung der schnellen Ermüdbarkeit der Muskelfasern. Es wird festgestellt, dass die funktionelle Expression von TRPC3, TRPC6 und TRPV4 in der Skelettmuskulatur der Maus bestätigt wurde. Die Ergebnisse erweitern die Kenntnisse über den Zusammenhang von Ca2+-Homöostase, MDX-Pathologie und TRP-Kanälen. Zwerchfelle aus alten MDX-Mäusen zeigten schwere Muskelschwäche, aber die restlichen Fasern des Zwerchfells zeigten einen starken Ermüdungswiderstand. Die Anwendung der TRPC3-Hemmer ist möglicherweise eine vielversprechende Therapie, um durch hohe intrazelluläre Ca2+-Spiegelvermittelte Schädigungen der Muskulatur bei Muskeldystrophie zu verhindern.

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Metadaten
Author: Joachim Yaxin Zhang
URN:urn:nbn:de:gbv:9-002567-1
Title Additional (English):Calcium regulation in normal and dystrophin-deficient muscle and the role of TRP channels
Title Additional (German):Kalzium-Regulation in normalen und Dystrophin-defizienten Muskeln und die Rolle von TRP-Kanälen
Advisor:Prof. Dr. Heinrich Brinkmeier
Document Type:Doctoral Thesis
Language:English
Date of Publication (online):2016/07/11
Granting Institution:Ernst-Moritz-Arndt-Universität, Universitätsmedizin (bis 31.05.2018)
Date of final exam:2016/06/16
Release Date:2016/07/11
Tag:TRP channels
GND Keyword:Calcium regulation, dystrophin deficient
Faculties:Universitätsmedizin / Institut für Pathophysiologie
DDC class:600 Technik, Medizin, angewandte Wissenschaften / 610 Medizin und Gesundheit