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Identifizierung und Charakterisierung von Imin-Reduktase

  • In dieser Arbeit wurden drei neue Imin-Reduktasen (IREDs) identifiziert und biochemisch charakterisiert. Bei einem dieser Enzyme war eine Kristallstruktur bereits gelöst, jedoch keine Funktionalität beschrieben. Beim Untersuchen des Substratspektrums wurde in dieser Arbeit erstmals festgestellt, dass neben zyklischen Iminen und Aminen auch azyklische Amine Substrate der IREDs sein können. Außerdem können IREDs Ketone oder Aldehyde als Substrate verwenden indem diese mit Ammoniak oder primären Aminen reduktiv aminiert werden. Es wurde die Kristallisation von den von uns neu entdeckten IREDs, sowie von 15 weiteren neuen IREDs untersucht. Für drei Enzyme konnten gut streuende Kristalle erhalten werden, wobei es zum ersten Mal für IREDs gelang, Kristalle bei der NADP+ Co-Kristallisation zu erhalten. Zwei dieser Enzyme tragen ungewöhnliche Reste im aktiven Zentrum (Glutamat und Asparagin). Bisher wurden meist Aspartat für (R)-selektive beziehungsweise Tyrosin für (S)-selektive IREDs beschrieben. Eine Ausnahme bildet die von uns charakterisierte IRED Ppu, welche ein Histidin einen Turn upstream (in der Sequenz weiter in Richtung C-Terminus) in der IRED trägt und im phylogenetischen Stammbaum eine dritte Gruppe von IREDs bildet. Neben der erstmalig berichteten Immobilisierung von IREDs, konnten wir mit Hilfe von rationalem Design eine Variante der Sgf3587 IRED erstellen, welche eine 3-fach erhöhte Akzeptanz von NADH zeigt. Da alle bisher beschriebenen IREDs NADPH stark präferieren, bildet die K40A-Variante der Sgf3587 IRED eine Alternative die den kostengünstigeren Cofaktor NADH verwenden kann. Eine andere von uns untersuchte Methode zur Kostenreduzierung ist die Verwendung eines Substrat-gekoppelten Ansatzes zur Cofaktor-Regenerierung. Hierbei wird ein zweites achirales sekundäres Amin eingesetzt, welches durch Oxidation des Substrats den Cofaktor reduziert, welcher dann für die Imin-Reduktion zur Verfügung steht. Die bisher beschriebenen Beispiele für die reduktive Aminerung zeigten eher geringe Umsätze. Sie wurden nur für drei Enzyme dargestellt. Mit Hilfe unseres Kooperationspartners konnten wir über 30 weitere Beispiele für Enzyme zeigen, welche die reduktive Aminierung durchführen können. Weiterhin konnten wir präparative Beispiele mit 1% (m/v) Substrat-Konzentration zeigen, wobei es gelang gute Umsätze und Reinheiten zu erlangen. Mit Hilfe der reduktiven Aminierung konnte außerdem die prinzipielle analytische Darstellung von Rasagilin, ein Alzheimer Medikament, gezeigt werden. Diese ist sehr vielversprechend und nach weiterer Optimierung wäre eine industrielle Anwendung möglich.
  • In this work, three new imine reductases (IRED) were identified and biochemically characterized. One of these enzymes, whose crystal structure was solved, however, no functionality was describes. While examining the substrate spectrum it was shown for the first time that, in addition to cyclic imines and amines, acyclic amines can be substrates of the IRED. Moreover, it could be shown, that ketones or aldehydes can be reductively aminated with ammonia or primary amines applying IREDs. The crystallization of these IREDs and 15 other new IREDs were investigated. For three enzymes good crystals could be obtained and it was demonstrated for the first time that IREDs crystals can be obtained of if NADP + was co-crystallized. Two of these enzymes carry unusual residues in the active site (glutamate and asparagine). So far, mostly aspartate for (R) -selective or tyrosine for (S) -selective IREDs are described. An exception is the in this work characterized IRED Ppu which carries a histidine one turn upstream (in the sequence in the direction of the C-terminus) of the IRED and forms a third group of IRED in phylogenetic tree. In addition immobilization of IREDs was reported the first time. We were able to design a variant of the IRED Sgf3587 showing a 3-fold increase in acceptance of NADH. Since all IRED described previously prefer NADPH strongly, the K40A variant of Sgf3587 IRED is an alternative, which can use the less expensive cofactor NADH. Another examined method to reduce costs is to use a substrate-coupled approach for cofactor regeneration. In this case, a second achiral secondary amine is used, which by oxidation of this substrate reduces the co-factor, who is then available for the imine reduction. The previously described examples for the reductive amination showed rather small turnovers, by only three different enzymes. With the help of our cooperation partner, we were able to show more than 30 other examples of enzymes show which can carry out the reductive amination. Furthermore, we were able to show preparative examples with 1% (m / v) substrate concentration, where it was possible to obtain good conversions and purities. Using the reductive amination, it was also possible to show the principal analytical scale preparation of rasagiline, an Alzheimer drug. This is very promising and, after further optimization an industrial application would be possible.

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Metadaten
Author: Martin Gand
URN:urn:nbn:de:gbv:9-002572-3
Title Additional (English):Identification and characterization of imine reductases
Advisor:Jun.-Prof. Dr. Matthias Höhne
Document Type:Doctoral Thesis
Language:German
Date of Publication (online):2016/07/20
Granting Institution:Ernst-Moritz-Arndt-Universität, Mathematisch-Naturwissenschaftliche Fakultät (bis 31.05.2018)
Date of final exam:2016/06/29
Release Date:2016/07/20
GND Keyword:Imin-Reduktase, Imine
Faculties:Mathematisch-Naturwissenschaftliche Fakultät / Institut für Chemie und Biochemie
DDC class:500 Naturwissenschaften und Mathematik / 540 Chemie