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Wechselwirkung genspezifischer Regulatorproteine mit pleiotropen Transkriptionsfaktoren der Hefe Saccharomyces cerevisiae

  • Die Hefe Saccharomyces cerevisiae reagiert auf die sich ständig ändernden Umweltbedingungen durch eine präzise Regulation der Genexpression. Möglich wird dies durch ein komplexes Netzwerk aus spezifischen Regulatoren und pleiotropen Faktoren. Aktivatorproteine binden an Aktivierungssequenzen (UAS-Elemente) in ihren Zielpromotoren und rekrutieren basale Transkriptionsfaktoren sowie Coaktiva¬toren. Dadurch erhöhen sich Wahrscheinlichkeit und Häufigkeit der Transkriptions¬initiation und die DNA im Promotorbereich wird durch die Aktivität von Komplexen der Chromatinremodellierung und -modifizierung für die Transkriptionsmaschinerie zugänglich gemacht. Dagegen binden spezifische Repressor¬proteine an ihre Regula¬tionssequenzen (URS-Elemente) oder an Aktivatorproteine, inhibieren deren Wirkung oder rekrutieren Histondeacetylase-Komplexe wie den Sin3-Corepressor, die eine Verdichtung des Chromatins bewirken. Der Sin3-Corepressorkomplex ist an einer Vielzahl von Regulationsprozessen beteiligt. In Hefe existieren zwei Sin3-Varianten, die als Rpd3L bzw. Rpd3S bezeichnet werden und sich in ihrer Zusammensetzung unterscheiden. Neben Sin3 als zentralem Gerüst¬protein in beiden Komplexen sind im Rpd3L strukturelle Untereinheiten wie Sds3, Sap30 und Pho23 sowie die Histondeacetylase (HDAC) Rpd3 als enzymatische Komponenten enthal¬ten. Durch Funktionsanalysen von Mutanten einzelner Unterein¬heiten wurde festge¬stellt, dass zusätzlich zu Rpd3 weitere HDACs an der Repression ICRE-abhängiger Gene der Phospholipid-biosynthese Gene beteiligt sind. Interaktionsstudien zeigten, dass auch die HDACs Hda1 und Hos1 an Sin3 binden. Die Bindung erfolgt über drei sogenannte HDAC-Interaktionsdomänen (HID1-3), wobei Hda1 und Hos1 an HID2 und HID3 binden, Rpd3 dagegen an HID1 und HID3. In dieser Arbeit konnte gezeigt werden, dass die HDACs direkt an ihre jeweiligen HIDs binden. Außerdem inter¬agieren Hda1 und Hos1 auch in vivo mit Sin3. Die HID1 wurde auf die Aminosäuren 801-950 verkürzt und es wurde nachge¬wiesen, dass eine funktionsfähige katalyti¬sche Domäne von Rpd3 nicht für die Wechselwirkung mit Sin3 notwendig ist. Außerdem wurden die Interaktionsdomänen von Sds3 und Sin3 kartiert. Die erhaltenen Befunde ergänzen die Daten zu Protein-Protein-Inter¬aktionen im Sin3-Corepressorkomplex und komplettieren funktionelle Aspekte der HDAC-Rekrutierung. Eine weitere Zielstellung dieser Arbeit war die Erstellung eines Interaktionsnetzwerks zwischen spezifischen Aktivatoren und allgemeinen Faktoren der Transkription. Eukaryotische Aktivatorproteine sind modular aufgebaut und besitzen voneinander separierbare Funktionsdomänen. Die Erkennung und Bindung von UAS-Elementen in den Zielpromotoren erfolgt über die DNA-Bindedomäne (DBD), während Tran¬skriptions¬¬aktivierungs¬domänen (TADs) basale Transkriptionsfaktoren und Co¬aktiva¬toren rekrutieren und somit die aktivierende Wirkung vermitteln. Im Gegensatz zu den DBDs folgen TADs meist keinen durch Sequenzanalysen vorhersagbaren Strukturmotiven und müssen manuell eingegrenzt werden. Für die Kartierung funktioneller TADs wurden Längenvarianten von über 30 Aktiva-toren aus verschiedenen Familien DNA-bindender Proteine an die Gal4DBD fusioniert und auf ihre Fähigkeit überprüft, ein UASGAL-abhängiges Reportergen zu aktivieren. Dabei konnten 15 neue TADs eingegrenzt werden. Weiterhin wurden die bisher nicht charakterisierten Zinkcluster¬proteine Yjl206c, Yer184c, Yll054c und Ylr278c als Aktivatoren bestätigt. Dadurch stand eine Samm¬lung aus 20 bekannten und neukartierten TADs zur Verfügung, die nach Konstruktion von GST-Fusionen für in vitro-Interaktionsexperimente mit Unter¬einheiten des Mediators, des TFIID- und des SWI/SNF-Komplexes eingesetzt wurden. Es konnten direkte Wechselwirkungen von Aktivatoren (u. a. Aft2, Aro80, Mac1 und Zap1) mit den TFIID-Komponenten TBP, Taf1, Taf4 und Taf5 detektiert werden. Die Bindung an Taf1 erfolgte im Bereich von aa 1-250, der zwei Aktivator¬interaktions-domänen (AID) enthält und in vorangegangenen Experimenten auch mit Ino2 und Adr1 interagierte. Die Rap1-Bindedomäne (RBD) von Taf4 (aa 253-344) interagierte auch mit Mac1, Aft2 und Ino2. Daher wurde dieser Bereich als allgemeine AID klassifiziert. Für die Aktivatorinteraktion essentielle Aminosäuren konnten allerdings nicht identi¬fiziert werden. 17 von 20 TADs interagierten direkt mit der Mediator-Untereinheit Med15, während für Med17 10 Kontakte zu Aktivatoren detektiert wurden, was die Relevanz des Mediators für die Aktivatorfunktion unterstreicht. Die katalytische Untereinheit des SWI/SNF-Komplexes Swi2 zeigte ähnlich viele TAD-Interaktionen wie Med15. Der N-terminale Bereich von Swi2 (aa 1-450) stellte sich als ausreichend für die Bindung der Aktivatoren heraus und enthält demnach eine oder mehrere AIDs. Damit konnte das Interaktionsnetzwerk zwischen Aktivatoren und allgemeinen transkriptionalen Cofaktoren substantiell erweitert werden.
  • Saccharomyces cerevisiae responds to changing environmental conditions with a precise regulation of gene expression. This adaptation is mediated by a complex network of specific regulators and general cofactors. Activator proteins bind to their upstream activation sites (UAS elements) and recruit basal transcription factors or coactivators. This results in an increasing number of transcriptional initiation events. As a consequence of chromatin remodeling and modifiying activities, the DNA structure in promoters becomes more accessible. On the other hand, specific repressor proteins bind to their upstream repression sites (URS elements) or to activator proteins and inhibit activator functions or recruit histondeacetylase complexes such as the Sin3 corepressor, inducing a more dense packaging of promoter chromatin. The Sin3 corepressor complex regulates a multitude of structural genes. In yeast, two complexes containing Sin3 have been identified, designated Rpd3L and Rpd3S which differ in molecular weight and number of subunits. While Sin3 acts as a scaffold for multiple protein-protein interactions in both complexes, Rpd3L contains structural subunits such as Sds3, Sap30 and Pho23 as well as the histone deacetylase (HDAC) Rpd3 which bears the enzymatic activity. Functional analysis of single mutants revealed that a sin3 null mutation leads to a severe loss of repression of ICRE-dependent genes while an rpd3 mutant was only slightly affected. Thus, additional HDACs must be involved in regulation of ICRE-dependent genes. Indeed, a triple mutant rpd3 hda1 hos1 showed deregulation similar to that of a sin3 mutant. Further in vitro interaction studies confirmed the binding of Hda1 and Hos1 to Sin3 via three so-called HDAC interaction domains (HID). All HDACs interact with HID3 while Hda1 and Hos1 bind to HID2 and Rpd3 is able to interact with HID1 exclusively. In this work, the direct binding of HDACs to their respective HIDs could be shown and binding of Hda1 and Hos1 to Sin3 was demonstrated in vivo. HID1 was mapped to amino acids 801-950 and a functional catalytic domain of Rpd3 turned out not to be necessary for interaction with Sin3. Within the Sds3 subunit of the corepressor complex, a C-terminal Sin3 interaction domain could be identified (aa 201-327), binding to HID1 of Sin3. Altogether, results obtained provide additional information on protein-protein-interactions within the Sin3 corepressor complex and complete functional aspects of HDAC recruitment. Another aim of this work was to establish a network of interactions between specific activators and general factors to learn more about mechanisms important for transducing a transcriptional signal. Eukaryotic activator proteins show a modular structure and contain functional domains which can be separated from each other. DNA-binding domains (DBD) are necessary for recognition and binding of UAS elements, while activation is executed via transcriptional activation domains (TAD), recruiting cofactors and coactivators. In contrast to DBDs, TADs do not share obvious structural motifs which could allow their in silico identification. Therefore, mapping must be carried out manually. For mapping of functional TADs, truncations of more than 30 activators were fused to Gal4DBD and assayed for their ability to induce an UASGAL-dependent reporter gene. Using this approach, 15 new TADs could be identified. In addition, zinc cluster proteins with unknown function Yjl206c, Yer184c, Yll054c and Ylr278c have been confirmed as transcriptional activators. Finally, a collection of 20 known and new TADs was available which was used for construction of GST fusion proteins and subsequent in vitro interaction experiments with components of Mediator, TFIID and SWI/SNF complex. Direct interactions with activators such as Aft2, Aro80, Mac1 and Zap1 were detected for TFIID subunits TBP, Taf1, Taf4 and Taf5. A domain of 250 amino acids at the N-terminus of Taf1 was sufficient for activator binding. This region contains two activator interaction domains (AID) which have been previously shown to interact with Ino2 and Adr1. The Rap1 binding domain (RBD) of Taf4 (aa 253-344) was also bound by Mac1, Aft2 and Ino2, indicating that it functions as a general AID. However, no individual amino acids essential for activator binding to Taf4 could be identified. 17 out of 20 TADs directly interacted with Mediator subunit Med15 and 10 activators bound to Med17. These results emphasize the importance of Mediator complex for activator function. The catalytic Swi2 subunit of SWI/SNF complex was also contacted by a number of TADs, similar to Med15. Interaction with activators was mediated by a region comprising amino acids 1-450 of Swi2, indicating the existence of one or more N-terminal AIDs. Taken together, the interaction network of activators and general transcriptional cofactors has been substantially extended by these results.

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Metadaten
Author: Mathias Grigat
URN:urn:nbn:de:gbv:9-002647-6
Title Additional (English):Interactions of specific regulatory proteins with pleiotropic transcription factors in the yeast Saccharomyces cerevisiae
Advisor:Prof. Dr. Hans-Joachim Schüller
Document Type:Doctoral Thesis
Language:German
Date of Publication (online):2016/10/26
Granting Institution:Ernst-Moritz-Arndt-Universität, Mathematisch-Naturwissenschaftliche Fakultät (bis 31.05.2018)
Date of final exam:2016/10/20
Release Date:2016/10/26
Tag:Coaktivator, Corepressor, Mediator, SWI/SNF, Sin3, TFIID
Mediator complex, TFIID, activator, transcriptional regulation
GND Keyword:Aktivatorprotein, Saccharomyces cerevisiae, Transkriptionsregulation
Faculties:Mathematisch-Naturwissenschaftliche Fakultät / Institut für Mikrobiologie - Abteilung für Genetik & Biochemie
DDC class:500 Naturwissenschaften und Mathematik / 570 Biowissenschaften; Biologie