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Molekulare und funktionelle Charakterisierung der Aktivierung von Granulozyten durch Antikörper gegen das Humane Neutrophilen-Antigen-3a

  • Die Transfusionsassoziierte Akute Lungeninsuffizienz (TRALI) ist die häufigste tödliche Nebenwirkung der Transfusion von Blutprodukten und wird oft durch mittransfundierte leukozytenreaktive Antikörper (AK) induziert. AK gegen das Humane Neutrophilenantigen (HNA)-3a verursachen häufig schwere Fälle der TRALI. HNA-3a ist auf dem Großteil der Blutzelltypen exprimiert und entsteht durch einen Einzelnukleotidpolymorphismus im Gen des „choline transporter-like protein 2“ (CTL2), welcher zur Substitution der Aminosäureposition 154 in der Sequenz des Proteins führt. Klinische Beobachtungen und zahlreiche Studien legen nahe, dass TRALI-induzierende AK die Akkumulation und Aktivierung von Granulozyten im Lungenkapillarbett verursachen. Durch den Zusammenbruch der Kapillarbarriere kommt es in der Folge zu einem Lungenödem. Die Entwicklung eines Hochdurchsatzverfahrens zur Detektion von HNA-3a-AK in Blutprodukten und die Identifizierung therapierelevanter Schaltstellen, im Pathomechanismus der HNA-3a-AK-induzierten TRALI, waren daher Hauptschwerpunkte dieser Studie. In diesem Zusammenhang wurde ein Nachweissystem für HNA-3a-AK auf der Grundlage von CTL2-Fragmenten etabliert. Ein Screening zahlreicher Anti-HNA-3a-Plasmen ergab, dass mit CTL2-Peptiden in Festphasentests jedoch nur etwa 50% aller HNA-3a-AK nachgewiesen werden können. Weitere Untersuchungen ergaben, dass die Detektion aller HNA-3a-AK nur mit zellbasierten Methoden möglich ist, bei denen CTL2 in seiner natürlichen Konformation vorliegt. Diese Studie leistet damit einen wichtigen Beitrag zur Charakterisierung des konformationssensitiven Epitops der HNA-3a-AK und identifiziert wichtige Grundvoraussetzungen für Methoden zum Nachweis dieser AK. Ein weiterer Schwerpunkt dieser Arbeit war die Untersuchung der Interaktion zwischen HNA-3a-AK und Granulozyten. Dieser experimentelle Ansatz gründet auf histopathologischen Lungenuntersuchungen verstorbener TRALI-Patienten, die eine massive Akkumulation und Aggregation von Granulozyten in den Kapillaren aufzeigen. Aus diesem Grund erfolgte die Untersuchung dieser Interaktion zunächst hinsichtlich verschiedener Parameter, die zu einer gesteigerten Sequestrierung von Granulozyten in der Lunge führen können. Hierzu gehören die Granulozytenaggregation (GA), die Versteifung von Zellen und die Zelladhäsion. Die Modifikation des Standard-Granulozytenaggregationstests ergab, dass die HNA-2- und HNA-3a-AK-induzierte GA aktive Prozesse sind, welche unabhängig von Plasmafaktoren stattfinden, jedoch von der Aktivität einer bislang noch nicht identifizierten Serinprotease abhängig sind. Hierbei wurden potente Aggregationsinhibitoren identifiziert welche auch als potenzielle Therapeutika zur Behandlung von TRALI in Frage kommen. Mit Hilfe desselben Testsystems konnte ermittelt werden, dass voraktivierte Granulozyten eine erhöhte Aggregationsneigung aufweisen. Im Zusammenhang mit dem Schwellenwertmodell der TRALI liefert dieses Ergebnis eine mögliche Erklärung, warum Patienten mit schweren Vorerkrankungen häufiger an TRALI erkranken. Neben der GA wurden in dieser Studie zwei weitere Eigenschaften identifiziert, die eine Akkumulation der Zellen in den engen Lungenkapillaren erklären: deren Elastizität und Adhäsivität. Mithilfe der Rasterkraftmikroskopie wurde nachgewiesen, dass HNA-3a-AK eine Versteifung von Granulozyten induzieren. Ebenso wurde gezeigt, dass HNA-3a-AK das Integrin Mac-1 (CD11b/CD18) auf der Granulozytenoberfläche aktivieren, was zu einer verstärkten Adhäsion der Zellen an Fibrinogen führt. Steifere und adhäsivere Granulozyten akkumulieren möglicherweise vermehrt in den Lungenkapillaren. Eine weitere wichtige Fragestellung dieser Studie war, ob HNA-3a-AK eine direkte Aktivierung von Granulozyten auslösen. Die Untersuchungen ergaben, dass die Aktivierung von CD11b, weder mit der Erhöhung der CD11b-Expression, bzw. mit der proteolytischen Abspaltung von L-Selektin, noch mit einer Sauerstoffradikalproduktion einhergeht. Dieses ungewöhnliche Muster an Veränderungen deutet nicht auf eine Aktivierung zytotoxischer Antworten hin. Seit kurzem ist bekannt, dass HNA-3a-AK Kapillarendothelzellen auch auf direktem Wege aktivieren und dass selbst in Granulozyten-depletierten Mäusen schwache TRALI-Symptome auftreten. Demzufolge ergibt sich ein neues Modell der HNA-3a-AK-induzierten TRALI: Nach Transfusion von HNA-3a-AK bleiben aggregierte, steifere und adhäsivere Granulozyten in den engen Lungenkapillaren stecken und interagieren dort mit dem aktivierten Gefäßendothel. Durch diese Interaktion kommt es vermutlich zur Aktivierung der Granulozyten und zu einer starken Inflammationsreaktion, welche eine weitere Zerstörung der Lungenkapillaren und schließlich ein schweres Lungenödem zur Folge hat. Die besondere Schwere der HNA-3a-AK-induzierter TRALI entsteht also vermutlich nicht aufgrund einer direkten und starken Granulozytenaktivierung, sondern vielmehr durch die gleichzeitige Beeinflussung verschiedener epitoptragender Zelltypen.
  • Transfusion-related acute lung injury (TRALI) is the leading cause of transfusion-associated fatalities and is frequently induced by leukocyte-reactive antibodies which are transfused with plasma-containing blood products. Antibodies (abs) directed against the human neutrophil alloantigen (HNA)-3a are often involved in severe and fatal TRALI reactions. HNA-3a is expressed on the majority of blood cell types and is caused by a single-nucleotide polymorphism in the gene encoding the choline transporter-like protein 2 (CTL2), resulting in a substitution of amino acid 154 in the amino acid sequence of the protein. Clinical investigations and a number of studies suggest that TRALI-inducing abs cause accumulation and activation of neutrophils in the pulmonary microvasculature, thereby inducing capillary leakage and lunge edema. The development of high throughput methods for the detection of HNA-3a abs and furthermore, identification of therapeutically relevant targets involved in the pathogenesis of HNA-3a antibody-induced TRALI, represent the main focus of the present study. Based on a library of CTL2 fragments, this study first addressed the development of a solid-phase immunoassay for the detection of HNA-3a abs in blood products. Screening of anti-HNA-3a plasmas revealed that assays based on these CTL2 peptides only detected half of the different HNA-3a antibody species. It became obvious, that binding of other antibody species is strictly dependent on the presentation of the native conformation of CTL2. Consequently, detection of the entirety of HNA-3a abs can only be achieved with cell-based assays presenting full-length CTL2 in its native structure. This study thereby contributed to the characterization of the conformation sensitive epitope of HNA-3a abs and identified basic requirements of high throughput assays for the detection of these abs. Another important part of this study focused on the interaction of HNA-3a abs with neutrophils. This concept was primarily based on histopathological lung investigations in fatal TRALI cases, showing sequestration and aggregation of neutrophils in the microvasculature. Consequently, this study investigated the impact of HNA-3a abs on various neutrophil features that could impede the transit through pulmonary capillaries: neutrophil aggregation, stiffening and adhesion. By modifying the standard granulocyte aggregation test (GAT), it was found that HNA-2 and HNA-3a antibody-induced neutrophil aggregation is an active process which is independent of plasma factors, but dependent on the activity of a not yet identified serine protease. Using the modified GAT, we identified potent inhibitors of granulocyte aggregation which were considered for further testing in TRALI animal models as possible therapeutics for the treatment of TRALI. In the view of the threshold model of TRALI, the increased aggregation response of primed neutrophils shown in this study also might be a possible explanation for the observation, that patients with severe comorbidities are more susceptible for TRALI-inducing abs. This study also identified two additional features potentially leading to neutrophil trapping in the pulmonary microvasculature: neutrophil stiffening and adhesion. HNA-3a abs induced significant neutrophil stiffening as measured by atomic force microscopy (AFM). In addition, flow cytometric analysis revealed a HNA-3a antibody-induced activation of the adhesion molecule Mac-1 (CD11b/CD18) which leads to increased adhesion of these cells to fibrinogen. Stiff and sticky neutrophils likely accumulate in the narrow microvasculature of the lung. Additionally, this study focused on the question whether HNA-3a-abs are capable of inducing direct neutrophil activation. However, HNA-3a abs did not lead to the production of reactive oxygen species. Additionally, although treatment of neutrophils with HNA-3a abs led to activation of CD11b, this was neither accompanied by an increased expression of the molecule, nor by a proteolytic cleavage of L-selectin (CD62L). This pattern of changes does not correspond to the typical phenotype of activated neutrophils and does not indicate direct induction of cytotoxicity. However, a recent study showed the induction of weak TRALI symptoms in neutrophil-depleted mice caused by direct HNA-3a antibody-induced activation of the endothelium. Taken together, activation of neutrophils very likely only occurs when aggregated, stiffened and adhesive neutrophils get trapped in the pulmonary capillaries and interact with the directly activated endothelium. Consequently, the pronounced potency of HNA-3a abs to induce TRALI seems not to be defined by a direct and strong neutrophil activation, but rather by a simultaneous impact of these abs on neutrophils, endothelial cells and possibly additional antigen-bearing cell types. The findings of the present study are therefore an important element of a new model for the pathogenesis of HNA-3a antibody-induced TRALI.

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Metadaten
Author: Tom Berthold
URN:urn:nbn:de:gbv:9-002657-1
Title Additional (English):Molecular and functional characterization of the activation of neutrophils by antibodies directed against the human neutrophil alloantigen-3a
Advisor:Prof. Dr. Andreas Greinacher, Prof. Dr. Uwe Völker
Document Type:Doctoral Thesis
Language:German
Date of Publication (online):2016/11/11
Granting Institution:Ernst-Moritz-Arndt-Universität, Mathematisch-Naturwissenschaftliche Fakultät (bis 31.05.2018)
Date of final exam:2016/10/24
Release Date:2016/11/11
Tag:Aktivierungsmarker, Antikörper, Granulozyten, Granulozytenaggregation, HNA-3a-Antikörper, Humanes Neutrophilenantigen-3a, Rasterkraftmikroskopie
Human neutrophil alloantigen-3a, Transfusion-related acute lunge injury, granulocytes
GND Keyword:Aktivierung, Blutübertragung, Immunglobulin, Leukozyt, Pathogenese, Transfusionsassoziiertes akutes Lungenversagen, Transfusionsmedizin
Faculties:Universitätsmedizin / Arbeitsgruppe "Funktionelle Genomforschung"
DDC class:600 Technik, Medizin, angewandte Wissenschaften / 610 Medizin und Gesundheit