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Zur Rolle des Kationenkanals TRPM7 bei der Differenzierung von Muskelzellen

  • Der TRPM7-Kanal ist ubiquitär exprimiert (Montell et al., 2005) und an multiplen physiologischen und pathologischen Prozessen beteiligt (Monteilh-Zoller et al., 2003). Durch TRPM7-Knockdown mittels siRNA wurde in dieser Arbeit versucht, die Bedeutung des Ionenkanals für die Differenzierungsfähigkeit von kultivierten Muskelzellen zu untersuchen. In Vorversuchen erfolgte die Etablierung der siRNA-Transfektionstechnik mit HEK293-Zellen nach zwei unterschiedlichen Protokollen. Zunächst konnte der TRPC6-Knockdown an TRPC6 überexprimierenden HEK293-Zellen gezeigt werden. Das Vorgehen wurde anschließend auf den zu untersuchenden Kanal TRPM7 in C57Bl-Zellen übertragen. Dazu musste die Methodik wiederholt abgewandelt werden, um möglichst viele vitale und transfizierte Zellen zu erhalten. Als Kontrollen dienten untransfizierte Zellen, mit unspezifischer siRNA-transfizierte Zellen und mit HiPerFect, dem Transfektionsreagenz, behandelte Zellen. Letztendlich konnte eine ausreichende Anzahl der transfizierten Zellen bezüglich ihrer Proliferation und Differenzierung anhand von zwei Differenzierungsmarkern, dem Ryanodinrezeptor 1 und dem SCN4A, untersucht werden. Dabei zeigten sich die folgenden Ergebnisse: Ein bis zwei Tage nach der Transfektion mit spezifischer siRNA zeigte sich eine verminderte Expression des TRPM7 in Muskelzellkulturen von ca. 50% im Vergleich zu den Kontrollen. Die Differenzierung der siRNA-transfizierten Zellen zeigte sich mikroskopisch deutlich eingeschränkt. Die Hemmung der TRPM7-Expression verlangsamte die Proliferation und Differenzierung der kultivierten Muskelzellen. Die beschriebenen Auswirkungen ließen sich aber nicht nur bei den siRNA-transfizierten Zellen, sondern teilweise auch bei Einsatz des HiPerFectes ohne zusätzliche siRNA erkennen. Die untransfizierten Zellen differenzierten – wie erwartet – am besten. Die Differenzierung der transfizierten Zellen war nicht abhängig von der Menge der siRNA. Die muskelspezifischen Marker, der Ryanodinrezeptor 1 und der spannungsgesteuerte Na+-Kanal SCN4A, waren nach siRNA-Anwendung gegen den TRPM7 tendenziell vermindert. Es zeigte sich jedoch auch eine Reduktion der Differenzierungsmarker in den transfizierten Kontrollgruppen. Zusammenfassend scheint der TRPM7 für Zellproliferation und Differenzierung von Muskelzellen relevant zu sein. Die C57Bl-Zellen reagierten allerdings recht sensitiv auf Transfektionen, so dass diesbezüglich nur eine eingeschränkte Aussage getroffen werden kann. Wegen seiner ubiquitären Expression, seiner Beteiligung an diversen physiologischen und pathophysiologischen Prozessen und seiner bedeutenden Rolle für die Mg2+-Homöostase bleibt der TRPM7 ein höchst interessanter und relevanter Ionenkanal.
  • The TRPM7 channel is ubiquitously expressed (Montell et al., 2005) and involved in multiple physiological and pathological processes (Monteilh-Zoller et al., 2003). In this dissertation the relevance of the channel for the differentiation of cultivated muscle cells has been investigated by TRPM7 knockdown. In pretests the siRNA transfection technique was established with a HEK293 cell line expressing the TRPC6 channel. Two different protocols were applied and TRPC6-knockdown by siRNA was convincingly demonstrated. Then, the method was transferred to the TRPM7 channel and C57Bl muscle cells. The methodology had to be adjusted to obtain a sufficient amount of vital and transfected cells. Non-transfected cells, cells transfected with non-specific siRNA as well as cells having been treated with the transfection reagent HiPerFect, served as controls. Finally, a sufficient amount of transfected cells could be analyzed regarding their proliferation and differentiation. Two markers were used to follow muscle specific differentiation, ryanodine receptor 1 and SCN4A. The following results were obtained: 1-2 days after transfection of muscle cells with specific siRNA, TRPM7 expression was reduced by 50% compared to the control groups. Microscopically, the differentiation of siRNA-transfected cells was considerably reduced. The inhibition of TRPM7 expression slowed down both, proliferation and differentiation of C57Bl cells. However, the effects were partially observed when using HiPerFect without additional siRNA. As expected, the non-transfected cells differentiated best. The muscle-specific markers ryanodine receptor 1 and the voltage gated Na+-channel SCN4A were slightly reduced after the siRNA knockdown of TRPM7. However, a reduction of the differentiation markers was also detected in the transfected control groups. The results indicate that the TRPM7 channel is relevant for cell proliferation and differentiation of muscle cells. However, the C57BI cells reacted sensitively to transfection so that the conclusion has to be regarded with caution. Because of its ubiquitous expression, its involvement in a range of physiological and pathophysiological processes including cellular Mg2+ homoeostasis the TRPM7 remains a highly interesting and relevant ion channel for further research.

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Metadaten
Author: Mareike Carina Stoll
URN:urn:nbn:de:gbv:9-002693-0
Title Additional (English):The role of TRPM7 cation channels in the differentiation of muscle cells
Advisor:Prof. Dr. Heinrich Brinkmeier
Document Type:Doctoral Thesis
Language:German
Date of Publication (online):2017/01/16
Granting Institution:Ernst-Moritz-Arndt-Universität, Universitätsmedizin (bis 31.05.2018)
Date of final exam:2016/12/14
Release Date:2017/01/16
Tag:C57Bl, TRP-Kanal, TRPM7, Transfektion, siRNA
C57Bl, TRP-channel, TRPM7, siRNA, transfection
GND Keyword:Calciumkanal, Geninaktivierung, Ionenkanal, Magnesium, Muskel, Transfektion
Faculties:Universitätsmedizin / Institut für Pathophysiologie
DDC class:600 Technik, Medizin, angewandte Wissenschaften / 610 Medizin und Gesundheit