Bitte verwenden Sie diesen Link, wenn Sie dieses Dokument zitieren oder verlinken wollen: https://nbn-resolving.org/urn:nbn:de:gbv:9-002834-7

Identifizierung und Charakterisierung von drei Cutinasen der Hefe Arxula adeninivorans LS3 und deren Einsatz zum Abbau von Polyestern

  • Die nicht-konventionelle, dimorphe, asexuelle und hemiascomycetale Hefe Blastobotrys (Arxula) adeninivorans wurde in den letzten Jahren in vielfältiger Weise eingesetzt und zahlreichen interessanten biotechnologischen Anwendungen unterzogen. Ein herausragendes Merkmal dieser Hefe ist das breite Substratspektrum, welches eine Vielzahl an Zuckern, Alkoholen sowie Purinen und Alkanen umfasst. In Folge der Genomsequenzierung des Stammes A. adeninivorans LS3 wurden drei putative Cutinase-Gene identifiziert. Cutinasen sind Serinhydrolasen, die in der Lage sind, Cutin der pflanzlichen Cuticula abzubauen. Dies ermöglicht es beispielsweise pflanzenpathogenen Pilzen wie Fusarium solani f. sp. pisi, die durch Cutin geschützten Bereiche zu penetrieren, um in die Wirtspflanze einzudringen. Trotz der Isolation von A. adeninivorans Stämmen aus Holzhydrolysat in Sibirien sowie humusreichen Böden wurde diese Hefe bisher nicht als pflanzenpathogen beschrieben. Auch das Vorhandensein von Cutinasen oder Cutinase-ähnlichen Enzymen blieb bisher gänzlich unbemerkt. Cutinasen sind für ein breites Spektrum an technischen Anwendungen zum Beispiel im Bereich des Abbaus und des Recyclings von bioabbaubaren Kunststoffen interessant. Aus diesem Grund wurden die drei Gene ACUT1, ACUT2 und ACUT3 aus dem Genom von A. adeninivorans LS3 isoliert. Mittels Homologie-Modellierung und Sequenzvergleich mit bekannten und charakterisierten Cutinasen konnten die α/β-Hydrolase Struktur, die katalytisch aktive S-D-H Triade mit dem in das G-Y-S-Q-G Motiv eingebetteten nucleophilen Serin, die Substratbindeschleife sowie die sogenannte „Flap-Helix“ identifiziert werden. Außerdem wies Acut3p eine einzigartige C-terminale Glycin-Threonin-Serin reiche Sequenz (GTS-Sequenz) auf, die unabhängig von der katalytisch aktiven Domäne gefaltet ist. Unter Verwendung des Xplor®2 Transformations/Expressionssystems wurden rekombinante Varianten der drei putativen Cutinasen Acut1-6hp, Acut2-6hp und Acut3-6hp mit A. adeninivorans G1212 synthetisiert, im Kulturüberstand lokalisiert sowie über den 6xHistidin-Tag gereinigt. Die anschließende biochemische Charakterisierung ergab ein nahezu uniformes Verhalten bezüglich pH-Optimum (pH 5,0 – 5,5) und Temperatur-Optimum (20 – 30 °C). Darüber hinaus wurde eine Instabilität der drei Cutinasen unter optimalen pH Bedingungen festgestellt. Diese konnte jedoch durch Zugabe von Osmolyten wie PEG200 vollständig behoben werden. Das Substratspektrum wurde als entscheidender Parameter für die Einordnung der putativen Arxula-Cutinasen untersucht. Die höchste Aktivität bei Substraten mit vier bis acht C-Atomen in der Acylkette entsprach dem Verhalten bereits bekannter Cutinasen. Weiterhin konnte der Abbau des Modellpolyesters Polycaprolacton sowie die Degradation von Apfelcutin erfolgreich durchgeführt werden, womit A. adeninivorans LS3 die erste ascomycetale Hefe mit nachgewiesenen cutinolytischen Enzymen ist. Zusätzlich konnte die im Vergleich zu Acut1-6hp und Acut2-6hp erhöhte Temperaturstabilität von Acut3-6hp auf die GTS-Sequenz zurückgeführt werden. Als mögliche Ursache für diesen Effekt wurde eine starke Glykosylierung der GTS-Sequenz angenommen. Durch Übertragung der GTS-Sequenz auf Acut1-6hp konnte die Temperaturstabilität dieses Enzyms erhöht werden. Eine Übertragung auf die bereits stark glykosylierte Tannase 1 führte dagegen nicht zu einer Erhöhung der Stabilität gegenüber der Temperatur. Weiterhin wurden in zwei verschiedenen Fermentationsverfahren mit Fed-Batch-Betriebsweise bis zu 1.000.000 U L-1 (Acut2-6hp) im Medium akkumuliert. Dies stellte bereits einen ersten Hinweis auf das Potenzial für eine Anwendung im technischen Bereich dar. Dieses Potenzial konnte durch den erfolgreichen Abbau von Polyestern wie Polycaprolacton, Polybutylensuccinat, Polylactid, Poly[3-Hydroxybutyrat] sowie Poly[3-Hydroxybutyrat-Co-3-Hydroxyvalerat] verstärkt werden. In weiteren Schritten müssen nun konkrete Anwendungsfelder für die in dieser Arbeit untersuchten Arxula-Cutinasen erschlossen werden. Der Abbau von real anfallenden Kunststoffabfällen aus bioabbaubaren und nicht-abbaubaren Folien oder Behältern sowie die Rückgewinnung der aus der Hydrolyse erhaltenen Monomere sollten dabei überprüft werden. Auf der anderen Seite wäre eine Anpassung der Kultivierungsmedien für die Gewinnung der Cutinasen im Pilot-Maßstab angebracht, um eine Produktionskostenreduktion zu erreichen.
  • In recent years, the non-conventional, dimorphic, asexual and hemiascomycetous yeast Blastobotrys (Arxula) adeninivorans has been exploited in many ways for interesting biotechnological applications. One extraordinary property of this organism is its wide substrate spectrum including besides different sugars and alcohols even purines as well as alkanes. However, the existence of cutinases in A. adeninivorans remained undiscovered until the identification of three genes encoding for putative cutinases in a genome sequencing approach. Cutinases are extracellular esterases which are enabling the penetration of the plant cuticle by plant pathogenic fungi. Furthermore, they are of interest for a wide range of industrial applications including the recycling of biodegradable polyesters. For this reason, in this work, the three genes ACUT1, ACUT2 and ACUT3 were isolated from genomic DNA of A. adeninivorans LS3. Important amino acid residues like the catalytic S-D-H triade, the substrate binding loop and the “flap-helix” as well as the α/β-hydrolase fold were identified by amino acid sequence alignment and homology modelling. Acut3p was found to contain a unique C-terminal serine, threonine and glycine rich peptide sequence (GTS-sequence). The recombinant, His-tagged versions Acut1-6hp, Acut2-6hp and Acut3-6hp were synthesized with A. adeninivorans as host system, subsequently purified and biochemically characterized. The optima for temperature (20 – 30 °C) and pH (5.0 – 5.5) as well as the instability in this pH range were found to be similar between all three Arxula cutinases. Also, their substrate spectra were comparable with other already known cutinases. An optimum for four to eight carbon atoms in the acyl-chain of fatty acid esters and the ability to hydrolyze the model polyester PCL as well as cutin isolated from apple peals finally confirmed that Acut1p, Acut2p and Acut3p are cutinases or cutinase-like enzymes. The well-known cutinase from Fusarium solani f. sp. pisi was used as a positive control for comparison. Additionally, it was shown that Acut3-6hp is more stable at higher temperatures than Acut1-6hp and Acut2-6hp possibly due to the glycosylation of the GTS-region as suggested previously. Therefore, this region was successfully transferred to Acut1p as well as tannase 1 from A. adeninivorans to increase their temperature stability. This approach was only advantageous for Acut1p since the original tannase 1 is already glycosylated. Finally, the ability for the degradation of polyester nanoparticles from polycaprolactone, poly[butylene succinate], poly[lactic acid], poly[3-hydroxybutyrate] and poly[3-hydroxybutyrate-co-3-hydroxyvalerate] as well as the high enzyme activity which could be achieved in fed-batch fermentations (1,000,000 U L-1 Acut2-6hp) shows a great potential of the A. adeninivorans three cutinases for industrial applications.

Download full text files

Export metadata

Additional Services

Share in Twitter Search Google Scholar
Metadaten
Author: Felix Bischoff
URN:urn:nbn:de:gbv:9-002834-7
Title Additional (English):Identification and characterization of three new cutinases of Arxula adeninivorans LS3 and their application in the degradation of polyesters
Advisor:Prof. Dr. Volkmar Passoth, Prof. Dr. Frieder Schauer
Document Type:Doctoral Thesis
Language:German
Date of Publication (online):2017/07/05
Granting Institution:Ernst-Moritz-Arndt-Universität, Mathematisch-Naturwissenschaftliche Fakultät (bis 31.05.2018)
Date of final exam:2017/05/08
Release Date:2017/07/05
GND Keyword:Arxula adeninivorans, Cutinase, Degradation, Esterasen, Polycaprolactone, Polyester
Faculties:Mathematisch-Naturwissenschaftliche Fakultät / Abteilung für Mikrobiologie und Molekularbiologie
DDC class:500 Naturwissenschaften und Mathematik / 570 Biowissenschaften; Biologie