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Leaf-inhabiting mycobiomes under different environmental conditions – local habitat conditions, leaf biochemistry and seasonal variations drive fungal community dynamics

  • Leaf-inhabiting fungi are a hyperdiverse group of microbiota found in all terrestrial habitats. Comparative studies targeting the drivers of endophytic fungal biodiversity are rare and identified multiple effectors, such as plant chemistry, climate and seasonal attributes. Our project aimed to study the pattern of the leaf-associated mycobiome of European beech (Fagus sylvatica) at altitudinally distinct sites to reveal diversity, composition and seasonal dynamics of fungal endophytes by a combination of metabarcoding, cultivation and subsequent ecological analyses. This thesis also intended to study the fungal relationship with biotic and abiotic factors: elevation, local site conditions, leaf biochemistry and leaf status. Metabarcoding and cultivation were applied for same leaf samples to trace both environmental drivers and method-dependent signals of the detected fungi. An experimental field site consisting of 100 (2-years old beech) trees was established called ‘beech phytometer’ system at two altitudes (517 and 975 m a.s.l.) in a German mountain forest. Beech trees were randomly selected from both sites as well as from neighboring beech trees. Ten trees from each site were chosen and 10 leaves per tree were sampled. Climatic and leaf biochemistry (Chlorophyll, flavonoid and nitrogen) data were seasonally (Autumn, Spring and Summer) investigated for two continuous years (Oct 2013 to Oct 2015) at these two elevations. In the first year (autumn, 2013) of the project (chapter 3.1), the leaf-inhabiting fungi of natural beech trees were investigated by using high-throughput sequencing (metabarcoding) at three altitudinally distinct sites (with timberline at 1381 m a.s.l.) in the German Alps. This paper focuses on a detailed description and evaluation of metabarcoding amplicon library preparation and a subsequent analytical workflow. Fungal diversity and community composition were compared as a function of different elevated sites and leaf status (i.e., vital or senescent). However, three investigation sites resulted in 969 OTUs (operational taxonomic units) from 820441 sequences. Taxonomic compositions (order) of beech fungi differed strongly among the three sites but were less distinct between the vital and the senescence leaves. Fungal community composition at valley site clearly differed from those of mountain and timberline where differences between mountain and timberline were less prominent. Vital and senescence leaf differed in fungal community structures indicating a strong dynamics of leaf fungi in autumn. Elevation and leaf status were found to be the main explaining factors, which affected the fungal richness and compositions. Another survey (Chapter 3.2) was conducted just after the establishment of the ‘beech phytometer’ trees in the same period (autumn 2013) where leaf mycobiome of the phytometer trees (trees originally came from Northern Germany and grown in nursery) were compared with the fungi of surrounding natural beech habitat at valley (517 m a.s.l.) and mountain site (975 m a.s.l.) in the same location “Untersberg”. Fungal diversity was lowest in the managed habitat in the nursery and was highest in natural habitat. Fungal diversity and compositions significantly associated the origin of the trees. Under natural conditions, the fungi were more diverse at lower altitudes than at higher altitudes. Additionally, leaf chlorophyll and flavonoid contents showed negative correlations with fungal richness in natural stands. In the second year (autumn 2014), another survey (chapter 3.3) was conducted on leaf endophytes of phytometer trees with metabarcoding and cultivation approaches to trace the environmental drivers and method-dependent indications. Metabarcoding resulted in 597 OTUs from 170480 curated ITS1 reads and cultivation revealed 70 OTUs from 438 culture-based Sanger sequences. Both approaches resulted in non-overlapping community compositions and pronounced differences in taxonomic classification and trophic stages. However, both methods revealed similar correlations of the fungal communities with local environmental conditions. Our results indicate undisputable advantages of metabarcoding over cultivation in terms of representation of the major functional guilds, rare taxa and diversity signals of leaf-inhabiting fungi. This stressed out the importance of cultivation for complementing sequence databases with good quality reference data and encouraged the use of both approaches in future microbial biodiversity assessment studies. Phytometer and natural trees were intensively investigated in this study (chapter 3.4) to assess the influence of site characteristics (altitudes, local microclimate), seasonality, leaf biochemistry and leaf age on fungal diversity and composition. In total, our analytical Illumina workflow resulted in 15703599 demultiplexed and ITS1 reads from 165 samples. Clustering at 97% similarity resulted in 1199 OTUs. Climatic parameters were significantly differed between valley and mountain on daily basis but were insignificantly differed on monthly basis. The compositional difference between phytometer and natural mycobiome was significant for combined data as well as for the seasonal data (Oct 2013-Oct 2014). We observed a strong seasonal turnover in phyllosphere fungi in both habitats over the two years of investigation, suggesting that the plant-fungal system not only responds to cyclic climatic conditions but depends as well on various parameters, e.g., geographic position, substrates age and surrounding vegetation. A side (chapter 3.5) study was done to see the connection between the foliar endophytes and foliar phenolic compounds of European aspen (Populus tremula) in the presence and absence of specialist beetles (Chrysomela tremula). A distinct pattern of the leaf endophytes was found to be associated with aspen genotype and chemotype, but this specificity disappeared in the presence of herbivorous beetles. This suggested that leaf endophytes responded to the herbivory in aspen. In general, the altitudinal difference is the most important explaining factor for fungal community differences, which shapes many dependent abiotic and biotic habitat factors. Regarding cost and time per sequence, metabarcoding is superior to cultivation approaches and offers surprisingly profound insights by yielding much more data, allowing to test at once multiple hypotheses in fungal ecology.
  • Blatt bewohnende Pilze sind eine hyperdiverse Organismengruppe in allen terrestrischen Ökosystemen. Vergleichende Studien über die treibenden Kräften endophytischer Biodiversität sind selten und haben vielfältige Effektoren identifiziert, wie die Biochemie der Pflanzen, das Klima und saisonale Aspekte. Unser Projekt mit Untersuchungsflächen auf unterschiedlichen Höhenstufen hatte zum Ziel, Muster von Blatt assoziierten der Rotbuche (Fagus sylvatica L.) zu erforschen. Die methodischen Schlüsselelemente waren Metabarcoding, Kultivierung und diverse ökologische Analysen. Diese Doktorarbeit hatte ebenfalls zum Ziel, pilzliche Interaktionen mit folgenden biotischen und abiotischen Parametern zu koppeln: Höhenstufen, Blattbiochemie und Blattalter. Metabarcoding und Kultivierung wurden für die identischen Blattproben durchgeführt um auch Methoden-abhängige Signale zu bewerten. Die Untersuchungsflächen bestanden aus je einem 10 x 10 Meter großen, gerodeten Areal auf 517 sowie auf 975 m.ü.NN, in das jeweils 100 2-jährige Buchen gesetzt wurden. Für die Probennahmen wurden jeweils 10 dieser Buchen ausgewählt, von denen je 10 Blätter abgenommen wurden. In der Fläche installierte Data logger zeichneten Temperatur und rel. Luftfeuchtigkeit auf, unmittelbar nach dem Sammeln wurden Chlorophyllgehalt, Flavonoidgehalt mit einem Dualex Flourometer gemessen. Die Untersuchungen dauerten 2 aufeinanderfolgende Jahre (Oktober 2013 bis Oktober 2015 und beinhalteten alle Jahreszeiten. Während des ersten Projektjahres (Kapitel 3.1) wurden die natürlichen Mycobiome in 3 unterschiedlichen Höhenstufen erfasst. Die daraus resultierende Publikation beschreibt detailliert sowohl die Laborschritte zur Illumina-Hochdurchsatz-Sequenzierung, als auch die bioinformatischen Notwendigkeiten zur Analyse der molekularen Daten. Diversität und Vergesellschaftung wurden in Abhängigkeit der Höhe und des Blattalters analysiert. 820.441 ITS1 Sequenzen gruppierten in 969 OTUs (Operational Taxonomic Units). Auf Ordnungsebene unterschied sich die taxonomische Zusammensetzung der Mycobiome in den 3 Höhenstufen mitunter deutlich. Dabei zeigten die beiden oberen Untersuchungsflächen deutlichere Ähnlichkeiten untereinander als zur Talfläche. Eine zweite Studie wurde direkt im Anschluss an die Etablierung der Untersuchungsflächen durchgeführt. (Kapitel 3.2). Dabei wurden das Mycobiom der natürlich gewachsenen Buchenblätter mit dem der eingebrachten (Phytometerbäume) verglichen. Pilzliche Diversität war am geringsten in den zweijährigen Buchen der Baumschule. Unter natürlichen Bedingungen zeigten die Buchenblätter weitaus geringere Chlorophyll und Flavonoid Werte und waren negativ korreliert mit pilzlicher Artenvielfalt. Im zweiten Jahr wurden nur noch die Phytometer Bäume untersucht (Kapitel 3.3), wobei dieses Mal der Einfluss der Untersuchungsmethode näher beleuchtet wurde. Kultivierungsversuche wurden mit der direkten Hochdurchsatz ITS Sequenzierung verglichen. Dieses Metabarcoding resultierte in 597 OTUs bei einer Gesamtzahl von 170480 ITS Sequenzen. Die Kultivierung lieferte dagegen nur 70 OTUs bei 438 Isolaten. Obwohl die Artengemeinschaften beider Methoden keine Überlappung zeigten, so zeigten beide Datensätze vergleichbare Signale hinsichtlich des Umweltparameters "Höhe". Die Ergebnisse deuteten auf deutliche Vorteile der Hochdurchsatzsequenzierung hin, unter anderem auf die Visualisierung einer höheren Diversität (hinsichtlich ökologischer Gruppen). Andereseits lieferte die Kultivierung ebenfalls verlässliche Daten, die für eine erste, kostengünstige Einschätzung der Diversitätsmuster nach wie vor wichtig ist. Es wird empfohlen, auch in Zukunft auf Kultivierungsversuche nicht gänzlich zu verzichten. Zusätzlich zu den auf die Buche beschränkten Studien wurde eine Arbeit an der Zitterpappel (Populus tremula) in die Doktorarbeit integriert (Kapitel 3.5). Dabei wurde die Anwesenheit eines auf diese Baumart spezialisierten Rüsselkäfers (Chrysomela tremula) untersucht. Unter anderem wurde herausgearbeitet, dass sich in Anwesenheit der Insekten die Diversitätsmuster endophytischer Pilze verändern

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Metadaten
Author: Abu Bakar Siddique
URN:urn:nbn:de:gbv:9-002881-5
Title Additional (German):Blatt bewohnende Mycobiome in unterschiedlihen Umweltbedingungen – lokale Standortbedingungen, Blattbiochemie und saisonale Aspekte bestimmen die Dynamik von Pilzgesellschaften
Advisor:Dr. Martin Unterseher
Document Type:Doctoral Thesis
Language:English
Date of Publication (online):2017/10/06
Granting Institution:Ernst-Moritz-Arndt-Universität, Mathematisch-Naturwissenschaftliche Fakultät (bis 31.05.2018)
Date of final exam:2017/09/18
Release Date:2017/10/06
Tag:Blatt bewohnende Pilze, Fagus sylvatica, Illumina-Hochdurchsatz-Sequenzierung, Kultivierung, Metabarcoding, Rotbuche
Altitudes, European beech, Fagus sylvatica, Fungal endophytes, High-throughput sequencing, Illumina, Metabarcoding
GND Keyword:Blatt bewohnende Pilze, Diversität, Fagus sylvatica, Rotbuche, Vergesellschaftung
Faculties:Mathematisch-Naturwissenschaftliche Fakultät / Institut für Botanik und Landschaftsökologie & Botanischer Garten
DDC class:500 Naturwissenschaften und Mathematik / 580 Pflanzen (Botanik)