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Molekular-epidemiologische Untersuchung veterinärmedizinisch relevanter RNA-Viren mittels Next-Generation Sequencing

  • Molekular-epidemiologische Untersuchungen veterinärmedizinisch relevanter Pathogene beruhen auf der Auswertung und Einordnung verlässlicher und detailreicher Sequenzinformationen. In den letzten Jahren haben sich die Sequenziermethoden des sogenannten Next-Generation Sequencing (NGS) kontinuierlich weiterentwickelt, so dass nun Nukleinsäureproben unterschiedlichster Herkunft zur Volllängensequenzierung viraler Genome herangezogen werden können. Des Weiteren sind Metagenomanalysen möglich geworden, d.h. die Untersuchung der Zusammensetzung der Organismenpopulation in einer Probe durch Sequenzierung der gesamten Nukleinsäurepopulation. Letzteres erlaubt auch die Untersuchung viraler Varianten in einer Probe (Quasispeziesanalysen). Im Rahmen der vorliegenden Arbeit wurden NGS-Methoden und Arbeitsabläufe zur Ausnutzung metagenomischer Datensätze optimiert, verfeinert und nachfolgend in praxisrelevanten Studien zu Lyssa- und Coronaviren erprobt. In einer ersten Studie zur Charakterisierung des neu entdeckten Bokeloh Fledermaus-Lyssavirus konnte gezeigt werden, dass es möglich ist, akkurate Volllängensequenzinformationen direkt aus Zellkulturüberständen zu generieren, die nicht nur die mittels der klassischen Kettenabbruch-Synthese generierten Daten bestätigen, sondern darüber hinaus auch virale Varianten aufzeigen. Eine detaillierte, hochauflösende Variantenanalyse (Tiefensequenzierung) lag im Fokus einer weiteren Studie zu Lyssaviren. Hier wurden kommerzielle Oralimpfstoffe gegen die Tollwut und ihre Ausgangsvirusstämme hinsichtlich ihrer Quasispezieszusammensetzung untersucht. Es konnte gezeigt werden, dass die Tiefensequenzierung einen wichtigen Beitrag zur Qualitätskontrolle (Stammidentität und -stabilität) eines Lebendimpfstoffes liefern kann, der in den Lizensierungsprozess eingebunden werden könnte. Dabei ist die Analyse auf Ebene der viralen Gesamtpopulation der Auswertung auf Konsensusebene überlegen. Metagenomische Datensätze erlauben nicht nur die Analyse viraler Populationen, es sind auch Wirtsinformationen ableitbar. Die kombinierte Auswertung viraler und wirtsspezifischer Informationen erlaubte eine phylogeographische Studie zur genetischen Diversität arktischer Tollwutviren und ihrer Reservoirwirte. Die Methode konnte erfolgreich angewendet werden um zu zeigen, dass es zwar eine räumliche Populationsstruktur bei den untersuchten Polarfüchsen gibt, diese jedoch nicht mit unabhängigen Tollwutvirusvarianten assoziiert werden können. Neben den oben genannten Lyssavirusprojekten waren zwei Studien zum Virus der porzinen epidemischen Diarrhoe Teil der vorliegenden Arbeit. Metagenomische Datensätze wurden verwendet, um Volllängensequenzen abzuleiten und diese phylogenetischen Detailanalysen und Netzwerk-Untersuchungen zu unterziehen. Außerdem konnten die Datensätze verwendet werden, um virale und bakterielle Koinfektionen zu untersuchen, die möglicherweise einen Einfluss auf die Schwere der Erkrankung gehabt haben könnten. Zusammenfassend konnte gezeigt werden, dass uns die optimierten NGS-Methoden in die Lage versetzen, metagenomische Datensätze zu nutzen, um nicht nur unverfälschte Volllängensequenzen für phylogenetische Detailanalysen zu generieren, sondern auch Quasispezies-Analysen durchzuführen sowie Wirts- und Virusfaktoren vergleichend zu untersuchen.
  • Molecular epidemiological studies of veterinary medicine-relevant pathogens are based on the evaluation and classification of reliable and detailed sequence information. In recent years, the sequencing methods of the so-called Next-Generation Sequencing (NGS) have continued to develop so that nucleic acid samples of various origin can be used for the full-length sequencing of viral genomes. Furthermore, metagenomic analysis have become possible, i.e. the study of the composition of the organism population in a sample by sequencing the entire nucleic acid pool. The latter also allows the investigation of viral variants in a sample (quasi-species analysis). As part of this work, NGS methods and workflows for the utilization of metagenomic datasets were optimized, refined and subsequently tested in practice-relevant studies on lyssa and coronaviruses. In a first study on the characterization of the newly discovered Bokeloh Bat lyssavirus, it was shown that it is possible to generate accurate full-length sequence information directly from cell culture supernatants. This full-length sequence information confirms not only the data generated by chain-termination synthesis rather they reveal viral variants. A detailed, high-resolution variant analysis (depth-sequencing) was the focus of another study on a lyssavirus. Here, commercial oral vaccines against rabies and their initial viral strains were investigated with regard to their quasispecies composition. It has been shown that the depth sequencing can provide an important contribution to quality control (strain identity and stability) of a live vaccine that could be involved in the licensing process. The analysis at the level of the overall viral population is far superior to the analysis at the consensus level. Metagenomic datasets not only allow the analysis of viral populations, but also host information can be derived. The combined evaluation of viral and host-specific information allowed a phylogeographic study on the genetic diversity of arctic rabies viruses and their reservoirs. The method was successfully used to show that there is a spatial population structure in the investigated polar foxes, but they can not be connected with independent rabies virus variants. In addition to the above-mentioned lyssavirus projects, two studies on the virus of the porcine epidemic diarrhea were also part of this work. Metagenomic datasets were used to derive full-length sequences and to undertake phylogenetic detailed analysis and network examinations. In addition, the datasets could be used to investigate viral and bacterial co-infections that might have had an effect on the severity of the disease. In summary, it was shown that the optimized NGS methods enable us to use metagenomic datasets in order not only to generate unadulterated full-length sequences for phylogenetic detailed analysis, but also to perform quasi-species analysis, as well as to compare host and virus factors.

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Metadaten
Author: Dennis Hanke
URN:urn:nbn:de:gbv:9-002970-2
Title Additional (English):Molecular epidemiology of RNA viruses with high impact in veterinary medicine using next-generation sequencing
Advisor:Dr. Rainer G. Ulrich
Document Type:Doctoral Thesis
Language:German
Date of Publication (online):2017/12/18
Granting Institution:Ernst-Moritz-Arndt-Universität, Mathematisch-Naturwissenschaftliche Fakultät (bis 31.05.2018)
Date of final exam:2017/12/07
Release Date:2017/12/18
Tag:Lyssavirus, molekulare Epidemiologie, porzines epidemisches Diarrhoevirus
Lyssavirus, Sequencing, Virology, molecular epidemiology, porcine epidemic diarrhea virus
GND Keyword:Sequenzanalyse <Chemie>, Tiermedizin, Tollwut, Virologie
Faculties:Mathematisch-Naturwissenschaftliche Fakultät / Abteilung für Mikrobiologie und Molekularbiologie
DDC class:500 Naturwissenschaften und Mathematik / 570 Biowissenschaften; Biologie
MSC-Classification:92-XX BIOLOGY AND OTHER NATURAL SCIENCES / 92Dxx Genetics and population dynamics / 92D20 Protein sequences, DNA sequences
92-XX BIOLOGY AND OTHER NATURAL SCIENCES / 92Dxx Genetics and population dynamics / 92D30 Epidemiology