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Genetic diversity and conservation biology of Moringa peregrina populations in Sinai, Egypt

  • Because Moringa is rich in secondary metabolites and phenolics, we faced a challenge in extracting a pure DNA required for AFLP (the first proposed genotyping method). Later, different DNA isolation methods were tested to overcome the obstacles caused by phenolics and sugars, an AFLP protocol that worked well with the cultivated seedlings at the botanical garden in Greifswald. The markers for the Internal Transcribed Spacer (ITS) were as well tested that showed a monomorphic structure between all samples. Finally, SSR (microsatellite) markers were established. To optimize DNA extraction, the method of Doyle and Doyle was modified and optimized. This is an ideal method for obtaining a non-fragmented DNA that could be used for AFLP. In addition, two other DNA extraction methods; (KingFisher Flex robot using Omega M1130 extraction Kits, and spin columns and 96-plates using Stratec kits). Although we achieved similar results for both Robot kits (Omega) and Stratec kits, the amplification for most of the samples extracted with Robot did not work, therefore the Stratec kit was the method of choice as it has also a lower cost, combined with a high quality of DNA. For ITS, no polymorphism was found for 28 samples of M. peregrina from Sinai (sequences submitted to GenBank). However, since microsatellite markers of M. peregrina were not known, it was a challenge to try a cross amplification from other species with well-known microsatellite primers. Cross-amplification of 16 primers known from the related species M. oleifera was tested, and three multiplex PCR reactions were established after testing different annealing temperatures and different primers concentrations. This included 13 primers out of the 16 investigated markers which gave a reliable band. All methods used for genetic assessments for the different Moringa species are compiled in a comparative review to look for connections between the different Moringa species. For Moringaceae, M. oleifera and M. peregrina are closely related to each other. Both species have slender trunks, with thick, tough bark and tough roots and bilaterally symmetrical flowers with a short hypanthium. All but one SSR markers used in this study are highly informative However, the degree of polymorphy varied considerably within the 13 markers used. The Probability of Identity (PI) for all loci was 2.6 x 10-9 with high resolution. The percentage of polymorphic loci for all populations was 88.5±2.2; figures for single populations were 92.3%, 84.6%, 84.6%, and 92.3% for the wadis WM, WA, WF, and WZ, respectively. The genotype accumulation curve as well demonstrated that 7–8 markers were necessary to discriminate between 100% of the multilocus genotypes. Significant departures from HWE were detected for eight loci (P < 0.001), probably due a high degree of inbreeding within population. The observed (HO) and expected (HE) heterozygosities ranged from 0 to 0.86 and from 0 to 0.81, respectively. However, for the pooled population, excluding the monomorphic locus MO41, HO and HE ranged from 0.069 to 0.742 and from 0.126 to 0.73 with averages of 0.423 and 0.469, respectively. The mean of FST was 0.133, indicating that, due to the long generation time of M. peregrina, there is still relatively little differentiation between the four remaining populations. An analysis of molecular variance (AMOVA) revealed that the old populations of M. peregrina are still genetically diverse where 75% of variance was recorded within individuals and 83% within populations. An analysis with STRUCTURE, varying the parameter K between 1 and 7, revealed the most pronounced genetic structure for K=3, thus uniting the populations from two neighboured wadis (W. Agala and W. Feiran). The three groups seem to be now genetically isolated. (They may be remainders of a formerly contiguous population, especially when considering the change towards a drier climate in Northern Africa within the last 6000 years). Six clones of each two individuals collected from the same wadi were found, pointing to vegetative dispersal via broken twigs, which may have rooted after flash floods. It may be an alternative mode of reproduction under harsh conditions. Our data reveal a low gene flow between three of the four wadis, suggesting that the trees are relictual populations. In general, conservation of populations from the three genetically most diverse wadis and cross-breeding of trees within a reforestation program is recommended as an effective strategy to ensure the survival of M. peregrina at Sinai, Egypt.
  • Da Moringa reich an Sekundärmetaboliten und Phenolen ist, war es eine Herausforderung, reine DNA extrahieren, die für AFLP (die erste in Betracht gezogene Genotypisierungsmethode) benötigt wird. Deshalb wurden verschiedene DNA-Isolierungsmethoden getestet, um die durch die hohe Konzentration von Phenolen und Zucker verursachten Hindernisse zu überwinden. Es wurde ein AFLP-Protokoll entwickelt, das mit den kultivierten Keimlingen im Botanischen Garten in Greifswald gut funktionierte; Marker für den Internal Transcribed Spacer (ITS) wurden getestet; und schließlich wurden SSR (Mikrosatelliten) Marker etabliert. Um die DNA-Extraktion zu optimieren, wurde die Methode von Doyle und Doyle modifiziert und optimiert. Dies ist eine ideale Methode, um eine nicht fragmentierte DNA zu erhalten, die für AFLP verwendet werden könnte. Darüber hinaus zwei weitere DNA-Extraktionsmethoden getestet (KingFisher Flex Roboter mit Omega M1130 Extraktions-Kits und Spin-Säulen und 96-Platten mit Stratec-Kits). Obwohl wir ähnliche Ergebnisse sowohl für die Robot Kits (Omega) als auch für die Stratec Kits erzielten, funktionierte die Amplifikation für die meisten mit Robot extrahierten Proben nicht, daher war das Stratec Kit die Methode der Wahl, da es geringere Kosten mit einer hohen DNA-Qualität kombiniert. Für ITS wurde für 28 Proben von M. peregrina aus Sinai (Sequenzen wurden an GenBank übermittelt) kein Polymorphismus gefunden. Da Mikrosatelliten-Marker von M. peregrina nicht bekannt sind, war es eine Herausforderung, eine Kreuz-Amplifikation von anderen Spezies mit bekannten Mikrosatelliten-Primern zu versuchen. Eine Kreuzamplifikation von 16 Primern, die aus der verwandten Art M. oleifera bekannt sind, wurde getestet, und drei Multiplex-PCR-Reaktionen wurden nach dem Testen verschiedener Anlagerungstemperaturen (annealing) und unterschiedlicher Primerkonzentrationen etabliert. Die Reaktionen funktionierten mit 13 von 16 untersuchten Markern, die eine zuverlässige Bande ergaben. Alle Methoden zur genetischen Bewertung der verschiedenen Moringa-Arten werden aus der Literatur zusammengestellt und in einer vergleichenden Übersicht zusammengefasst (Kapitel 3.4, unveröffentlichtes Manuskript), um nach Gemeinsamkeiten zwischen den verschiedenen Moringa-Arten zu suchen. innerhalb der Familie Moringaceae sind M. oleifera und M. peregrina eng miteinander verwandt. 12 von 13 SSR-Marker, die in dieser Studie verwendet wurden, sind sehr informativ. Der Grad der Polymorphie variiert innerhalb der 13 verwendeten Marker für verschiedene Genorte) beträchtlich. Die Wahrscheinlichkeit der Identität (PI) für alle Loci betrug 2,6 × 10-9. Der Prozentsatz der polymorphen Loci für alle Populationen betrug 88,5 ± 2,2; Die Zahlen für einzelne Populationen betrugen 92,3%, 84,6%, 84,6% und 92,3% für die Wadis WM, WA, WF bzw. WZ. Eine Akkumulationskurve der Genotypen zeigte, auch, dass 7-8 Marker notwendig waren, um zwischen 100% der Multilocus-Genotypen zu unterscheiden. Signifikante Abweichungen von HWE wurden für acht Loci gefunden (P <0,001), wahrscheinlich aufgrund eines hohen Inzuchtgrades innerhalb der Population. Für jedes der vier untersuchten Wadis lag die beobachtete (HO) und erwartete (HE) Heterozygosität zwischen 0 und 0,86 bzw. zwischen 0 und 0,81. Für die gepoolte Population mit Ausnahme des monomorphen Locus MO41 lagen HO und HE jedoch zwischen 0,069 und 0,742 und zwischen 0,126 und 0,73 mit Durchschnittswerten von 0,423 bzw. 0,469. Der Mittelwert der genetischen Differenzierung (FST) betrug 0,133, was darauf hindeutet, dass aufgrund der langen Generationszeit von M. peregrina immer noch relativ wenig zwischen den vier verbleibenden Populationen unterschieden wird. Eine Analyse der molekularen Varianz (AMOVA) ergab, dass die alten Populationen von M. peregrina immer noch genetisch unterschiedlich sind, wobei 75% der Varianz innerhalb von Individuen und 83% innerhalb von Populationen aufgezeichnet wurden. Eine Analyse mit dem Programm STRUCTURE variierte den Parameter K zwischen 1 und 7 und zeigte die stärkste genetische Struktur für K = 3, wodurch die Populationen aus zwei benachbarten Wadis (W. Agala und W. Feiran) vereinigt wurden. Die drei Gruppen scheinen nun genetisch isoliert zu sein. (Sie können Reste einer ehemals zusammenhängenden Population sein, besonders wenn man die Veränderung in Richtung eines trockeneren Klimas in Nordafrika in den letzten 6000 Jahren betrachtet). Sechs Klone von jeweils zwei Individuen, die aus demselben Wadi gefunden wurden, die auf vegetative Verbreitung durch gebrochene Zweige hinwies, die nach Sturzfluten verwurzelt sein können. Unsere Daten zeigen einen geringen Genfluss zwischen drei der vier Wadis, was darauf hindeutet, dass die Bäume reliktische Populationen sind. Zusammenfassend wird die Erhaltung der Populationen aus den drei genetisch sehr unterschiedlichen Wadis und die Kreuzung von Bäumen innerhalb eines Wiederaufforstungsprogramms als wirksame Strategie empfohlen, um das Überleben von M. peregrina im Sinai, Ägypten, zu gewährleisten.

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Metadaten
Author: Mohamed Awad DadamounyORCiD
URN:urn:nbn:de:gbv:9-opus-23450
Title Additional (German):Genetische Diversität und Naturschutzbiologie der Populationen von Moringa peregrina in Sinai, Ägypten
Referee:Prof. at Universität Regensburg, Germany Christoph Oberprieler, Prof. at Universität Greifswald, Germany Christine Stöhr, Prof. at Universität Greifswald, Germany Jürgen Kreyling, Prof. at Universität Greifswald, Germany Gerald Kerth, Dr. at Universität Greifswald, Germany Peter König
Advisor:Prof. at Universität Greifswald, Germany Martin Schnittler
Document Type:Doctoral Thesis
Language:English
Year of Completion:2018
Date of first Publication:2018/10/15
Granting Institution:Universität Greifswald, Mathematisch-Naturwissenschaftliche Fakultät
Date of final exam:2018/08/21
Release Date:2018/10/15
Tag:Molekularbiologie, Genotypisierung, Genetische Diversität
AFLP, microsatellite SSR, ITS, DNA isolation
GND Keyword:Genetic diversity, Genotyping, Molecular biology
Pagenumber:125
Faculties:Mathematisch-Naturwissenschaftliche Fakultät / Institut für Botanik und Landschaftsökologie & Botanischer Garten
DDC class:500 Naturwissenschaften und Mathematik / 500 Naturwissenschaften