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Sascha Troschke-Meurer

• Das Neuroblastom ist eine pädiatrische Tumorerkrankung, die ihren Ursprung in undifferenzierten Nervenzellen des sympathischen Nervengewebes hat. Das ereignisfreie 5-Jahresüberleben von Hochrisikopatienten liegt trotz der Einführung neuer gegen das Disialogangliosid GD2-gerichteter Antikörpertherapien weiterhin nur bei ca. 50 %. Daher ist es wichtig, die Biomarker zu finden, die helfen, Patienten zu identifizieren, die bisher noch nicht von den etablierten Therapieansätzen profitieren. In dieser Arbeit wurden immunologische und genetische Parameter untersucht, die möglicherweise als Biomarker für das Ansprechen auf eine GD2-gerichtete Immuntherapie in Kombination mit Interleukin 2 (IL-2) dienen können. Dafür wurde der Einfluss der zytotoxischen NK-Zellen, Granulozyten (Eosinophile und Neutrophile) und regulatorischen T-Zellen (Treg) sowie der Zytokine IFN-γ, IL-6, IL-10, IL-18 und CCL2 auf die antikörperabhängige zelluläre Zytotoxizität (antibody-dependent cellular cytotoxicity, ADCC) und dem ereignisfreien Überleben analysiert. Weiterhin wurde die Rolle von patientenspezifischen FCGR2A-H131R und 3A-V158F-Polymorphismen sowie die Killer-cell immunoglobulin-like receptors (KIR) und KIR-Liganden (KIRL)-Genotypen bei einer Immuntherapie evaluiert. 53 Patienten haben bis zu fünf Zyklen Immuntherapie erhalten. Ein Zyklus beeinhaltete zunächst fünf Tage 6×106 IU/m2/Tag IL-2-Behandlung (Tage 1 - 5), gefolgt von einer Langzeitinfusion von dem anti-GD2-Antikörper ch14.18/CHO (Tage 8 - 18) in Kombination mit 6×106IU/m2/Tag IL-2 (Tage 8 – 12). Die Zahl der Effektorzellen und die Zytokinserumkonzentrationen wurden mittels Durchflusszytometrie ermittelt und die FCGR-Polymorphismen und KIR/KIRL-Genotyp mit einer validierten Real-Time-PCR bestimmt. Die ADCC wurde mittels eines Calcein-AM basierten Zytotoxizitätstest erfasst. Die IL-2-Monotherapie an den Tagen 1-5 steigerte die Zahl der NK-Zellen, der Treg und der Eosinophilen stark im Vergleich zum Basiswert (Zyklus 1, Tag 1). Die Expansion der Neutrophilen wurde hingegen erst nach dem Start der Antikörperbehandlung beobachtet (Tag 15). IFN-γ, IL-6, IL-10, IL-18 und CCL2 erreichten ihre Spitzenkonzentrationen ebenfalls erst während der Antikörpertherapie. Überraschenderweise korrelierte weder die NK-Zell- noch die Granulozytenzahl mit der ADCC und dem ereignisfreien Überleben der Patienten. Hingegen zeigten Patienten mit einer starken Expansion der Treg signifikant niedrigere IFN-γ-Serumkonzentrationen sowie ein schlechteres ereignisfreies Überleben im Vergleich zu Patienten mit niedriger Treg-Zahl. Außerdem hatten Patienten mit hoher IL-18-Serumkonzentration währender der Antikörpertherapie ein signifikant verbessertes Überleben verglichen mit Patienten mit niedriger IL-18-Serumkonzentration. Zusammenfassend wurde eine starke Induktion der Treg beobachtet, die invers mit der IFN-γ-Serumkonzentration und dem ereignisfreien Überleben der Patienten korrelierte. Die Patienten mit den hochaffinen FCGR2A-131H- und 3A-158V-Polymorphismen zeigten einen höhere ADCC und ein verlängertes ereignisfreies Überleben gegenüber den Patienten mit den FCGR2A-131R- und 3A-158F-Polymorphismen. Patienten mit aktivierenden KIR (Genotyp B/x), insbesondere dem KIR2DS2, zeigten eine gesteigerte ADCC und ein verlängertes ereignisfreies Überleben verglichen mit den Patienten mit dem inhibitorischen KIR-Genotyp ohne aktivierende KIR (Genotyp A/A). Entsprechend hatten Patienten mit dem vorteilhaften KIR2DS2 und hochaffinen FCGR-Polymorphismen die stärkste Induktion der ADCC und das längste ereignisfreie Überleben im Vergleich zu Patienten mit inhibitorischen KIR-Genotyp und niedrigaffinen FCGR-Polymorphismen. In dieser Arbeit wurde gezeigt, dass KIR- und FCGR2A- und 3A-Genotypen die ADCC sowie das Ansprechen auf eine ch14.18/CHO-basierte Immuntherapie in Kombination mit IL-2 beeinflussen und daher in Zukunft als Biomarker für diese Therapie dienen können. Schließlich erwiesen sich FCGR-Polymorphismen in Kombination mit der Treg-Zahl als Biomarker zur Identifizierung von Patienten, die kein Ansprechen auf die Immuntherapie gezeigt hat. Zusammenfassend konnte in dieser Arbeit gezeigt werden, dass immunologische und genetische Parameter als prädiktive Biomarker einer antikörperbasierten Immuntherapie bei Patienten mit Hochrisikoneuroblastom verwendet werden können, um Patienten zu identifizieren, die von der bisherigen Immuntherapie nicht profitieren würden. Für solche Patienten müssen alternative Therapieoptionen angeboten werden um einen schnellen Rückfall der Erkrankung zu verhindern.
• Neuroblastoma is a malignant disease originated from primordial neural crest cells. Despite the introduction of anti-GD2-based immunotherapies, the 5-year event-free survival of high-risk Neuroblastoma patients is still about 50%. Therefore, it is important to find biomarkers allowing to identify patients that still do not benefit from the current treatment modalities. The following potential immunological and genetic biomarkers were investigated in patients who received an anti-GD2 treatment in combination with Interleukin 2 (IL-2) were: Cytotoxic NK-, granulocytes- (neutrophils and eosinophils) and regulatory T cell (Treg) as well as the cytokines IFN-γ, IL-6, IL-10, IL-18 and CCL2. Moreover, FCGR2A-H131R and 3A-V158F-polymorphisms as well as killer-cell immunoglobulin-like receptors (KIR) und KIR-ligands (KIRL) genotypes, that have been shown to impact the outcome of immunotherapies, were evaluated. Correlation between all parameters and the antibody-dependent cellular cytotoxicity (ADCC) and the event-free survival was statistically analyzed. 53 patients received up to five cycles immunotherapy with 6×106 IU/m2 subcutaneous IL-2 prior to and in combination with (days 1-5 and 8–12, respectively) the long-term infusion (LTI) of 100 mg/m2 anti-GD2-antibody ch14.18/CHO (days 8-18). Effector cell counts and cytokine serum concentrations were assessed by flow cytometry. FCGR polymorphism and KIR/KIRL genotypes were determined by real-time PCR and ADDC was analyzed by calcein-AM-based cytotoxicity assay Administration of IL-2 (days 1-5) resulted in increased cytotoxic NK cell-, eosinophil- and Treg numbers, whereas neutrophils were elevated after the start of the antibody LTI. Similarly, peak serum concentrations of IFN-γ, IL-6, IL-10, IL-18 and CCL2 were observed only during the combined treatment with ch14.18/CHO and IL-2. Surprisingly, we did not find any impact of therapy-related NK-cell- and granulocyte counts on ADCC and event-free survival. However, patients with high Treg counts showed low IFN-γ serum concentration and poor event-free survival probabilities compared to those patients with low Treg. Interestingly, patients with high IL-18 levels, that were detected during the Ab-treatment, showed significantly improved survival compared to those patients with low IL-18. In summary, we observed an Il-2-dependent induction of Treg that inversely correlated with IFN-γ serum concentration and event-free survival. Next, patients with high-affinity FCGR2A-131H and 3A-158F polymorphisms showed a stronger induction of ADCC compared to those who had low-affinity FCGR. These results translated into improved event-free survival probabilities of high-affinity patients compared to the low-affinity cohort. Similarly, patients with the activating KIR-genotype B/B, particularly, when KIR2DS2 was present, showed higher ADCC levels and improved event-free survival compared to those patients with the inhibitory KIR-genotype A/A. Accordingly, the highest ADCC and longest event-free survival were observed in patients when the presence of KIR2DS2 and high-affinity FCGR2A- and 3A were combined. In summary, FCGR polymorphisms and the presence of KIR2DS2 showed a major effect on ADCC and event-free survival and therefore might present biomarker to predict the outcome of a GD2-directed immunotherapy. Finally, we identified patients with particularly poor outcome, when FCGR-polymorphisms and Treg-counts were combined. In conclusion, immunological and genetic parameters can be used as predictive biomarkers of an anti-GD2 immunotherapy in patients with high-risk neuroblastoma. For patients that still not benefit from this therapy, alternative treatment options should be considered to prevent early relapse.