Venkata Komaragiri

• Cell mechanical properties are a popular label-free method for understanding basic cellular processes. In this thesis, I used Real-time deformability cytometry (RT-DC), a high-throughput microfluidic technology, to investigate the mechanical properties of cells and mitochondria under various conditions such as increased reactive oxygen species (ROS) levels and the application of different ligand coated gold nano-particles (Au-Nps) effect on cells. Initially, we showed the possibility to measure organelles, cells, and tissue-like structures (spheroids) in a single system by constructing a virtual fluidic channel. We investigated a potential application using cytochalasin D (cyto D) treatment, which revealed increased deformation and decreased stiffness in both the normal and virtual channels. Using mechanics as a marker, I investigated the effect of excessive ROS on the mechanical properties of human myeloid precursor cells (HL60). My findings suggest that the mechanical response of HL60 cells to increased ROS levels is mediated by re-localization of microtubules toward the cell center and F-actin to the cell periphery. Interestingly, I also observed intracellular acidification, which is a largely unexplored mechanism that may have contributed to our findings. I then extended our ROS and mechanics assay to investigate cell-AuNP interactions, demonstrating that cell properties vary depending on the cell culture media and ligand coating. The results showed that dextran coated gold nano-particels (Au-Nps) had low cytotoxicity, lower ROS release, and no change in cell mechanics, indicating a potential application for dextran Au NPs. Finally, I expanded our assays to include high-throughput microfluidic characterization of isolated mitochondria. Using both exogenously and endogenously induced ROS, we found an increase in mitochondrial deformation and a decrease in their size, which could have implications on mitochondrial function, i.e., fission and fusion. We believe that advanced applications of RT-DC technology will improve the comparability of results across different sample sizes while also promoting it as a disease detection technique.
• Die mechanischen Eigenschaften von Zellen sind eine beliebte markierungsfreie Methode zum Verständnis grundlegender zellulärer Prozesse. In dieser Arbeit habe ich die Echtzeit-Verformbarkeitszytometrie (RT-DC), eine mikrofluidische Technologie mit hohem Durchsatz, eingesetzt, um die mechanischen Eigenschaften von Zellen und Mitochondrien unter verschiedenen Bedingungen zu untersuchen, z. B. bei erhöhtem Gehalt an reaktiven Sauerstoffspezies (ROS) und der Anwendung verschiedener mit Liganden beschichteter Gold-Nanopartikel (Au-Nps), die auf Zellen wirken. Zunächst zeigten wir die Möglichkeit, Organellen, Zellen und gewebeähnliche Strukturen (Sphäroide) in einem einzigen System zu messen, indem wir einen virtuellen Fluidikkanal konstruierten. Wir untersuchten eine mögliche Anwendung unter Verwendung einer Behandlung mit Cytochalasin D (Cyto D), die sowohl in den normalen als auch in den virtuellen Kanälen eine erhöhte Verformung und verringerte Steifigkeit ergab. Unter Verwendung der Mechanik als Marker untersuchte ich die Auswirkung von übermäßigem ROS auf die mechanischen Eigenschaften von menschlichen myeloischen Vorläuferzellen (HL60). Meine Ergebnisse deuten darauf hin, dass die mechanische Reaktion von HL60-Zellen auf erhöhte ROS-Konzentrationen durch die Re-Lokalisierung von Mikrotubuli in Richtung Zellzentrum und von F-Aktin in die Zellperipherie vermittelt wird. Interessanterweise habe ich auch eine intrazelluläre Ansäuerung beobachtet, ein weitgehend unerforschter Mechanismus, der zu unseren Ergebnissen beigetragen haben könnte. Anschließend habe ich unseren ROS- und Mechanik-Assay erweitert, um die Zell-AuNP-Interaktionen zu untersuchen und zu zeigen, dass die Zelleigenschaften je nach Zellkulturmedium und Ligandenbeschichtung variieren. Die Ergebnisse zeigten, dass mit Dextran beschichtete Gold-Nanopartikel (Au-Nps) eine geringe Zytotoxizität, eine geringere ROS-Freisetzung und keine Veränderung der Zellmechanik aufweisen, was auf eine mögliche Anwendung von Dextran-Au-NPs hindeutet. Schließlich erweiterte ich unsere Assays um die mikrofluidische Charakterisierung isolierter Mitochondrien im Hochdurchsatzverfahren. Unter Verwendung sowohl exogen als auch endogen induzierter ROS stellten wir eine Zunahme der mitochondrialen Deformation und eine Abnahme ihrer Größe fest, was Auswirkungen auf die mitochondriale Funktion, d. h. die Spaltung und Fusion, haben könnte. Wir sind davon überzeugt, dass fortschrittliche Anwendungen der RT-DC-Technologie die Vergleichbarkeit der Ergebnisse bei unterschiedlichen Probengrößen verbessern und sie gleichzeitig als Verfahren zur Erkennung von Krankheiten fördern werden.