Jonathan Bennewitz

• Inhalt der Arbeit war die quantitativen Analysen des Vorkommens verschiedener Proteinkinasen (AMPK, ERK 1/2, Akt und mTOR) insgesamt und in phosphorylierter Form in H9c2 Zellen in Abhängigkeit der Expression von Renin. Da entsprechende Kinasen durch Phosphorylierung aktiviert werden, gilt die Ratio von phosphorylierter zu unphosphorylierter Proteinkinase als Maß für die Aktivität der jeweiligen Kinase. Die Quantitative Analyse erfolgte semiquantitativ mittels Westernblot. Die Quantifizierung der Expression der jeweiligen Renintranskripte erfolgte mittels real-time RT-PCR. Zusätzliche erfolgten Stimulationsexperimente in der Zellkultur, von welchem eine Aktivierung der zu untersuchenden Proteinkinasen zu erwarten ist, zwecks Verifikation der Sensitivität und Spezifität der Antikörperbindung. Die Analysen wurden mit H9c2-Zellen durchgeführt, welche das verkürzte Renin-Isotranskript ohne Intronsequenz 1A (Renin E2-9), mit Intronsequenz 1A (ReninE1A-9) und das unverkürzte Renin-Isotrankript (ReninE1-9) überexprimierten. In Abhängigkeit der Überexpression des jeweiligen Renintrankriptes zeigten sich signifikante Unterschiede der Ratio der Phosphorylierung der verschiedenen Proteinkinasen Die Arbeit zeigt, dass H9c2-Zellen, welche das Tanskript RenE1A-9 und RenE2-9, jedoch nicht RenE1-9 überexprimierten, eine erhöhte Ratio der Phosphorylierung (S473) für Akt (p-Value: < 0,05%) im Vergleich zu den Kontrollzellen aufwiesen. Für mTOR zeigte sich ebenfalls eine Erhöhung der Ratio für die Phosphorylierungsstelle S2448 jedoch, bedingt durch die erhöhte Varianz, mit Verfehlung des Signifikanzniveaus mit einem p-Value von 0,066 und 0,051 (für jeweils RenE2-9 und RenE1A-9). Die Phosphorylierung an der Stelle S2481 ließ sich aufgrund der geringen Antikörperbindung nur schwer quantifizieren, signifikante Unterschiede zwischen den verschiedenen Zellreihen (Kontrollzellen, RenE1A-9, RenE2-9, RenE1-9) zeigten sich nicht. Für RenE1-9 überexprimierende H9c2-Zellen zeigten sich hingegen keine signifikanten Unterschiede der Phosphorylierung beider Phosphorylierungsstellen von mTOR im Vergleich zu den Kontrollen. H9c2-Zellen welche die Renintranskripte RenE1A-9 und RenE2-9 überexprimierten Unterschieden sich hinsichtlich der Ratio von pAMPK(Th172)/AMPK nicht von den Kontrollzellen. H9c2 Zellen, welche das Reninranskript RenE1-9 überexprimierten zeigte im Vergleich zu den Kontrollzellen eine signifikant erhöhte Ratio von pAMPK(Th172)/AMPK (p-Value < 0,05). Nur H9c2-Zellen, welche das Renintranskript RenE1-9 überexprimierten wiesen eine erhöhte Ratio von pERK 1/2 (T202/Y204)/ERK 1/2 im Vergleich zu den Kontrollzellen auf (p-Value <0,01). Der zweite Teil der Arbeit beschäftig sich mit der Auswirkung eines transienten Knockdowns der Expression des cytosolischen Renintranskriptes durch si-RNA auf die Phosphorylierung der jeweiligen Proteinkinasen (Akt, mTOR,, AMPK). Die Verifikation eines erfolgreichen Knock-Downs erfolgte durch die quantitative RT-PCR-Analyse. Die Expression des zytosolischen Renintrankriptes wurde durch Anoxie stimuliert. Lediglich H9c2-Zellen, welche einem vorherigen Knock-Down ausgesetzt waren, jedoch nicht die Kontrollzellen ohne Knock-Down, wiesen eine signifikant verminderte Ratio von pmTOR(S2448)/mTOR unter Anoxie auf. Eine Erhöhung der Ratio von pAkt(S473)/Akt und pAMPK(Th172)/AMPK zeigte sich Unabhängig von einem vorherigen Knock-Down nach Anoxie in H9c2-Zellen. Zusammenfassend zeigen die Daten, dass eine Überexpression des verkürzten Renintranskriptes, sowie eine kurzfristige Stimulation der Expression, ein metabolisches Remodelling in H9c2-Zellen induziert. Der Phänotyp des metabolischen Remodellings zeigt hierbei Übereinstimmungen mit dem sogenannten Warburg-Effekt insbesondere in Anbetracht der Aktivierung der hier untersuchten Proteinkinasen. H9c2-Zellen, welche die unverkürzte Version des Renintrankriptes überexprimierten, zeigten jene Veränderungen nicht und ähnelten hierbei eher dem Phänotyp der Leervektor H9c2-Kontrollzellen. Im Besonderem wiesen H9c2-Zellen mit Überexpression des sekretorischen Renins eine Stimulation der ERK/AMPK-Signalkaskaden auf, welche als Folgeerscheinungen des sekretorischen ,,RAS-signaling‘‘ interpretiert werden können.