Niklas Dörmann

• In den Industrieländern zählen kardiovaskuläre Erkrankungen zu den häufigsten Todesursachen. Pathologische linksventrikuläre Hypertrophie (LVH) und Herzinsuffizienz mit reduzierter Ejektionsfraktion (HFrEF) sind mit einer erhöhten Morbidität und Mortalität der betroffenen Patienten assoziiert. Bei der pathologischen LVH kommt es zu einer inadäquaten Reaktion des Herzens (maladaptives Remodeling) auf verschiedene Stressreize, wie z.B. Drucküberlastung durch eine Aortenklappenstenose oder eine arterielle Hypertonie. Das kardiale Remodeling wird von Kardiomyozyten-Hypertrophie, interstitieller und perivaskulärer Fibrose begleitet. Damit einhergehend kommt es zu Veränderungen des kardialen Proteoms und zu einem Anstieg kardialer Stressmarker (ANF, BNP, α-Skelett-Aktin) sowie zu einer Verschiebung des Verhältnisses von α-MyHC zu β-MyHC. Unter physiologischen Bedingungen ist der Stoffwechsel des Herzens überwiegend auf die Verwertung freier Fettsäuren durch die Fettsäureoxidation (FAO) und nur in geringem Maße auf die Verwertung von Glukose durch die Glukoseoxidation (GO), Laktat, Ketonkörpern und Aminosäuren zur ATP-Generierung ausgerichtet. Unter pathologischen Bedingungen, wie bei LVH und HFrEF, kommt es zu einer metabolischen Verschiebung, die sich in einer verminderten FAO und einer erhöhten GO äußert und als metabolisches Remodeling bezeichnet wird. Untersuchungen zum Zusammenhang zwischen metabolischem und kardialem Remodeling haben gezeigt, dass das metabolische Remodeling den strukturellen Störungen (kardialem Remodeling) in den Kardiomyozyten vorausgeht. Ein Regulator metabolischer Prozesse ist der nährstoffsensitive Transkriptionsfaktor EB (TFEB). TFEB fördert die Expression von Genen, die an der FAO (PGC-1α/PPARGC1A, PPARα/PPARA), der GO (HKII/HK2, GLUT1/SLC2A1, GLUT4/SLC2A4, und IRS2/IRS2) und der Energiegewinnung durch oxidative Phosphorylierung (OXPHOS, Komplex I-V) beteiligt sind. TFEB könnte daher eine Rolle beim stressinduzierten metabolischen Remodeling des Herzens spielen. In bereits publizierten Arbeiten führte die Überexpression von TFEB in murinen Herzen unter physiologischen und pathologischen Bedingungen zu einem erhöhten kardialen Remodeling und einer reduzierten Herzfunktion. Aus diesen Erkenntnissen wurde folgende Hypothese formuliert: "Die Deletion von Tfeb im Herzen verhindert das kardiale Remodeling durch Unterdrückung des metabolischen Remodelings und führt so zu einer verbesserten Herzfunktion unter chronischer Drucküberlastung". Zur Bestätigung dieser Hypothese wurde im ersten Teil dieser Arbeit untersucht, ob eine Kardiomyozyten-spezifische Deletion von Tfeb das metabolische und kardiale Remodeling in männlichen Mäuseherzen während einer durch TAC-induzierten LVH und HFrEF beeinflusst und ob die Deletion von Tfeb zu einer Verbesserung der Herzfunktion führt. Die Untersuchungen zeigten, dass unter physiologischen Bedingungen die Kardiomyozyten-spezifische Deletion von Tfeb (TfebloxP/loxP; αMHC-CRE; cKO) im Vergleich zu Kontrollen (TfebloxP/loxP; WT) zu einer leicht verminderten Herzfunktion und zu einem kardialen und metabolischen Remodeling führt. Um den Einfluss der Tfeb-Deletion unter pathologischen Bedingungen zu untersuchen, wurde in WT- und cKO-Mäusen eine LVH bzw. HFrEF durch 21- bzw. 56tägige transversale Konstriktion der Aorta thorakalis (TAC, 27G) induziert. Schein-operierte Geschwistertiere, die derselben Prozedur unterzogen wurden, allerdings ohne Aortenkonstriktion, wurden als Kontrollen verwendet. Die 21-tägige TAC-Behandlung führte zu LVH und die 56-tägige TAC-Behandlung führte zu HFrEF sowohl bei WT- als auch bei cKO-Mäusen. Morphologische, histologische und qRT-PCR-Analysen zeigten ein erhöhtes Herzgewicht, interstitielle Fibrose und eine Zunahme der Expression kardialer Stress- und Remodeling-Gene bei LVH und HFrEF in cKO- und WT-Mäusen, respektive. Proteomanalysen der Herzen zeigten eine Hemmung der FAO und der OXPHOS in HFrEF, was auf eine Verschiebung des Metabolismus von FAO zu GO hinweist. Im LVH-Modell wurden keine Veränderungen der Herzfunktion, wenige Unterschiede im metabolischen Remodeling, jedoch ein erhöhtes kardiales Remodeling in cKO- im Vergleich zu WT-Mäusen beobachtet. Im Modell der HFrEF zeigte der cKO eine verbesserte linksventrikuläre Ejektionsfraktion, Verkürzungsfraktion und Herzzeitvolumen. Damit einhergehend zeigten die cKO Tiere eine weniger starke Zunahme der linksventrikulären Masse, kleinere Myozyten-Querschnittsflächen und ein geringeres Herzgewicht als die WT-Tiere nach TAC. Im Modell der LVH zeigten die cKO Tiere ein erhöhtes kardiales Remodeling wohingegen im Modell der HFrEF ein geringerer Anstieg von Myh7 und β-MyHC zwischen cKO- und WT-Mäusen gefunden wurde. Diese Daten zeigen, dass die cKO-Mäuse eine bessere Herzfunktion in der TAC-induzierten Drucküberlastung haben und dass eine Verminderung von TFEB im Modell der HFrEF von Vorteil sein könnte. Hinsichtlich des metabolischen Remodelings wurden keine Unterschiede zwischen cKO- und WT-Mäusen gefunden. Aufgrund der Ergebnisse des ersten Teils dieser Arbeit stellte sich die Frage, ob die Überexpression von TFEB das metabolische Remodeling bzw. die Energiehomöostase in Kardiomyozyten stärker beeinflusst als die Deletion von Tfeb. Daher wurden im zweiten Teil dieser Arbeit die Veränderungen der zellulären Atmung, der ATP-Produktionsraten und die metabolischen Veränderungen im Proteom nach Überexpression von TFEB in Kardiomyozyten untersucht. Die Überexpression von TFEB in Kardiomyozyten führte zu einer Verschiebung der metabolischen Aktivität von einer primär OXPHOS-orientierten Atmung hin zu einer stärker glykolytisch-orientierten Atmung und insgesamt zu einer erhöhten (energiereicheren) metabolischen Aktivität bzw. Atmung. Dies war mit einer höheren ATP-Produktionsrate und einer Zunahme der maximalen Atmung und der Reserve Atmungskapazität assoziiert. Die erhöhte Reserve Atmungskapazität ermöglicht es den Kardiomyozyten, besser auf einen erhöhten Energiebedarf zu reagieren und erhöht die Flexibilität der Kardiomyozyten in Stresssituationen. Das Proteom zeigte, dass die Überexpression von TFEB die Abundanz mitochondrialer Proteine erhöht und die OXPHOS aktiviert. Diese Ergebnisse zeigen den positiven Einfluss von TFEB auf den Energiemetabolismus und seinen Einfluss auf das metabolische Remodeling in Kardiomyozyten. Zusammenfassend zeigen die Ergebnisse dieser Arbeit, dass die Überexpression und Deletion von Tfeb in Kardiomyozyten in Abhängigkeit von den vorherrschenden physiologischen und pathologischen Bedingungen (LVH und HFrEF) sowohl positive als auch negative Auswirkungen auf die Energiehomöostase und die Herzfunktion haben kann. Schlüsselwörter: TFEB, linksventrikuläre Hypertrophie, Herzinsuffizienz mit reduzierter Ejektionsfraktion, metabolisches Remodeling, Fettsäureoxidation, transversale Aorten-Konstriktion.
• In industrialized countries, cardiovascular diseases are among the leading causes of death. Pathological left ventricular hypertrophy (LVH) and heart failure with reduced ejection fraction (HFrEF) are associated with increased morbidity and mortality in affected patients. In pathological LVH, there is an inadequate response of the heart (maladaptive remodelling) to various stress stimuli, such as pressure overload due to aortic valve stenosis or arterial hypertension. Cardiac remodelling is accompanied by cardiomyocyte hypertrophy, interstitial and perivascular fibrosis. This is accompanied by changes in the cardiac proteome and an increase in cardiac stress markers (ANF, BNP, α-skeletal actin) as well as a shift in the ratio of α-MyHC to β-MyHC. Under physiological conditions, cardiac metabolism is predominantly directed towards the utilization of free fatty acids through fatty acid oxidation (FAO) and only to a small extent towards the utilization of glucose through glucose oxidation (GO), lactate, ketone bodies and amino acids for ATP generation. Under pathological conditions, such as in LVH and HFrEF, there is a metabolic shift that manifests as decreased FAO and increased GO and is referred to as metabolic remodelling. Studies on the relationship between metabolic and cardiac remodelling have shown that metabolic remodelling precedes structural disturbances (cardiac remodelling) in cardiomyocytes. One regulator of metabolic processes is the nutrient-sensitive transcription factor EB (TFEB). TFEB promotes the expression of genes involved in FAO (PGC-1α/PPARGC1A, PPARα/PPARA), GO (HKII/HK2, GLUT1/SLC2A1, GLUT4/SLC2A4, and IRS2/IRS2) and energy production by oxidative phosphorylation (OXPHOS, complex I-V). TFEB may therefore play a role in stress-induced metabolic remodelling of the heart. In previously published work, overexpression of TFEB in murine hearts, under physiological and pathological conditions, resulted in increased cardiac remodelling and reduced cardiac function. From these findings, the following hypothesis was formulated: "Deletion of Tfeb in the heart prevents cardiac remodelling by suppressing metabolic remodelling, leading to improved cardiac function under chronic pressure overload". To confirm this hypothesis, the first part of this work investigated whether cardiomyocyte-specific deletion of Tfeb affects metabolic and cardiac remodelling in male mouse hearts during TAC-induced LVH and HFrEF, and whether deletion of Tfeb leads to improved cardiac function. The studies showed that under physiological conditions, cardiomyocyte-specific deletion of Tfeb (TfebloxP/loxP; αMHC-CRE; cKO) leads to slightly reduced cardiac function and cardiac and metabolic remodelling compared to controls (TfebloxP/loxP; WT). To investigate the influence of Tfeb deletion under pathological conditions, LVH and HFrEF were induced in WT and cKO mice by 21- and 56-day transverse constriction of the thoracic aorta (TAC, 27G), respectively. Sham-operated siblings subjected to the same procedure but without aortic constriction were used as controls. The 21-day TAC treatment induced LVH and the 56-day TAC treatment induced HFrEF in both WT and cKO mice. Morphological, histological and qRT-PCR analyses showed increased heart weight, interstitial fibrosis and increased expression of cardiac stress and remodelling genes in LVH and HFrEF in cKO and WT mice, respectively. Proteomic analyses of the hearts showed inhibition of FAO and OXPHOS in HFrEF, indicating a shift in metabolism from FAO to GO. In the LVH model, no changes in cardiac function, few differences in metabolic remodelling, but increased cardiac remodelling were observed in cKO compared to WT mice. In the HFrEF model, the cKO showed improved left ventricular ejection fraction, fractional shortening and cardiac output. Concomitantly, the cKO animals showed less increase in left ventricular mass, smaller myocyte cross-sectional areas and lower heart weight than the WT animals after TAC. In the LVH model, the cKO animals showed increased cardiac remodelling whereas in the HFrEF model, a smaller increase in Myh7 and β-MyHC was found between cKO and WT mice. These data indicate that the cKO mice have better cardiac function in TAC-induced pressure overload and that a reduction of TFEB may be beneficial in the HFrEF model. No differences were found between cKO and WT mice with regard to metabolic remodelling. Based on the results of the first part of this work, the question arose whether overexpression of TFEB affects metabolic remodelling or energy homeostasis in cardiomyocytes more strongly than deletion of Tfeb. Therefore, in the second part of this work, the changes in cellular respiration, ATP production rates and metabolic changes in the proteome after overexpression of TFEB in cardiomyocytes were investigated. Overexpression of TFEB in cardiomyocytes resulted in a shift in metabolic activity from primarily OXPHOS-oriented respiration to more glycolytic-oriented respiration and overall increased (higher energy) metabolic activity or respiration. This was associated with a higher ATP production rate and an increase in maximal respiration and reserve respiratory capacity. The increased reserve respiratory capacity allows cardiomyocytes to respond better to increased energy demands and increases cardiomyocyte flexibility in stressful situations. The proteome showed that overexpression of TFEB increased the abundance of mitochondrial proteins and activated OXPHOS. These results demonstrate the positive influence of TFEB on energy metabolism and its impact on metabolic remodelling in cardiomyocytes. In summary, the results of this work show that overexpression and deletion of Tfeb in cardiomyocytes can have both positive and negative effects on energy homeostasis and cardiac function depending on the prevailing physiological and pathological conditions (LVH and HFrEF). Keywords: TFEB, left ventricular hypertrophy, heart failure with reduced ejection fraction, metabolic remodelling, fatty acid oxidation, transverse aortic constriction.