Lukas Zierke

• Die akute Pankreatitis ist einer der häufigsten gastroenterologischen Erkrankungen, wobei deren Pathogenese auf zellulärer Ebene noch nicht vollständig aufgeklärt ist. Bekannt ist, dass beginnend mit einer hohen cytosolischen Ca2+-Konzentration eine intrazelluläre Aktivierung von Trypsin eintritt, was zu einer Proteasenaktivierung in den pankreatischen Azinuszellen führt. Dies resultiert letztendlich im Tod dieser Zellen und in der Aktivierung des Immunsystems. Wie Trypsin, welches im sekretorischen Kompartiment lokalisiert ist, über das überwiegend lysosomal lokalisierte Cathepsin B aktiviert wird, bleibt jedoch ungeklärt. Um diese Fragestellung zu untersuchen, wurde über einen pankreasspezifischen Knockout von Rab7 die Fusion von sekretorischen Vesikeln und Lysosomen inhibiert und nachfolgend die subzelluläre Verteilung der Enzyme vor und nach Stimulation der Mäuse mit Caerulein untersucht. Dabei fiel auf, dass bei Fehlen von Rab7 alle untersuchten Cathepsine erhöht exprimiert und verstärkt im sekretorischen Kompartiment lokalisiert vorlagen. Dies hatte jedoch keinen Einfluss auf die Trypsinaktivität oder den Beginn der Erkrankung, was sowohl in isolierten Azinuszellen als auch in vivo gezeigt werden konnte. Zu einem späteren Zeitpunkt nahm die Schwere der akuten Pankreatitis in den knockout Mäusen zu. In einem weiteren Modell erfolgte eine Vorbehandlung von Wildtyp (C57BL/6) Mäusen mit der lysosomotropen Substanz Glycyl-L-Phenylalanin 2-Naphthylamid (GPN). Dabei konnte gezeigt werden, dass auch nach Permeabilisierung der Lysosomen durch Caerulein eine intrazelluläre Trypsinaktivierung und akute Pankreatitis induziert wurde und der pankreatische Schaden im Wesentlichen unverändert zu den Kontrollen war. Ein zweiter Ansatz fokussierte sich auf den intrazellulären Transport der Cathepsine. Mithilfe eines knockout Mausmodells für CLN8 sollte der Export von lysosomalen Proteinen vom rauen Endoplasmatischen Retikulum in das cis-Golgi Netzwerk inhibiert und Cathepsin B weder das Lysosom noch das sekretorische Kompartiment erreichen und somit nicht für die Aktivierung von Trypsinogen zur Verfügung stehen. In dieser Arbeit konnte allerdings gezeigt werden, dass trotz Deletion von CLN8 Cathepsine im lysosomalen und imsekretorischen Kompartiment lokalisiert sind, Trypsinogen nach Cholecystokinin- bzw. Caerulein-Stimulation intrazellulär aktivierbar sind und eine akute Pankreatitis initiiert werden kann. Das Fehlen von CLN8 führte im Pankreas zu einer vermehrten Bildung von Autophagosomen, zu dysmorphen und dysfunktionalen Mitochondrien und einem erhöhten ER-Stress, wie anhand von elektronenmikroskopischen Aufnahmen, Messung des maximalen mitochondrialen Membranpotentials und der ATP-Synthese sowie Expressionsanalysen der ER-Stress Proteine BIP, ATF6 und CHOP nachgewiesen werden konnte. Expressionsanalysen und Co-Immunopräzipitationen von LC3B sowie dem ER-Phagie regulierenden Rezeptor FAM134B zeigten eine stärkere Expression beider Proteine in CLN8 knockout Mäusen, die sich während der akuten Pankreatitis weiter erhöhte, was darauf hindeutet, dass die ER-Phagie eine wichtige Rolle für die Pathogenese der akuten Pankreatitis bei Defizienz von CLN8 darstellt. Deletion von CLN8 mittels CRISPR/Cas9 in 266-6 Zellen, einer murinen Azinuszelllinie, bestätigte, dass das Fehlen von CLN8 mit einem erhöhten ER-Stress verbunden ist. Gleichzeitig waren eine verminderte Zellproliferation und Veränderungen der Zellmorphologie in CLN8-defizienten 266-6 nachweisbar. Zusammengefasst verdeutlichen die Ergebnisse, dass die Initiation der akuten Pankreatitis ohne Lysosomen stattfinden kann. Weder eine Inhibition der Fusion von Zymogengranula und Lysosomen, noch eine Störung der Membranintegrität, hervorgerufen durch die lysosomotrophe Substanz GPN, oder eine Störung des Exports von Cathepsinen aus dem ER verhinderten die Induzierbarkeit der akuten Pankreatitis. Diese Beobachtungen stellen die Notwendigkeit der Fusion von Lysosomen mit Zymogengranula als essenzielle Vorraussetzung für den Beginn der akuten Pankreatitis in Frage. Unsere Beobachtungen lassen im Gegenteil sogar die Vermutung zu, dass Lysosomen in der akuten Pankreatitis eine krankheitsmildernde Funktion haben könnten.
• Acute pancreatitis is one of the most common gastrointestinal diseases, but its pathophysiology is still unknown. The pathogenesis starts with an increase of the cytosolic Ca2+ concentration leading to an intracellular trypsinogen activation and a cascade-like activation of digestive proteases that finally results in organ injury and cellular death. Several previous studies demonstrate, that the lysosomal enzyme cathepsin B (CTSB) is able to proteolytically activate trypsinogen. However, the underlying mechanisms of the CTSB-mediated trypsinogen activation are still not entirely understood. To answer this question, we have induced acute pancreatitis by caerulein injections in mice with a pancreas-specific knockout of Rab7, a small GTPase that is implicated in the intracellular transport and fusion of lysosomes with secretory vesicles. Deficiency of Rab7 in the pancreas prevented a subcellular distribution of CTSB from the lysosomal to the secretory compartment but still enabled an intracellular activation of CTSB and trypsinogen followed by the onset of acute pancreatitis. These effects were observed both in isolated acinar cells and in vivo. Loss of pancreatic Rab7 expression even increased the severity of acute pancreatitis during later disease stages (8 hours). In a separate experimental setup, the proper lysosomal function was impaired using the lysosomotropic substance glycyl-L-phenylalanine 2-naphthylamid (GPN) in wild-type (C57BL/6) mice. Despite lysosomal membrane permeabilization trypsinogen activation and acute pancreatitis still occurred and disease severity was similar to control mice. In a third model, we investigated the effect of a blocked export of cathepsins from the endoplasmatic reticulum to the cis-Golgi network by a knockout model of CLN8 in mice, in isolated acinar cells and 266-6 cells. Upon CCK- or caerulein-stimulation CLN8-deficient acinar cells and mice still developed acute pancreatitis which was transiently milder in the early phase but turned to be more severe at later disease stages. Loss of CLN8 increased autophagosome formation and led to dysmorphic mitochondria with impaired function and ER stress which could be demonstrated by electron microscopy, measurement of the maximal mitochondrial membrane potential, and ATP-synthesis as well as the expression of ER stress markers BIP, ATF6, and CHOP. Analysis of expression and co-immunoprecipitation of LC4B with the ER-phagy regulating receptor FAM134B showed an increased expression of both proteins in CLN8 knockout mice which was further enhanced during acute pancreatitis indicating an important role of ER-phagy in the pathogenesis of acute pancreatitis. Deletion of CLN8 by CRISPR/Cas9 in 266-6 cells confirmed the association of CLN8 deficiency with higher ER stress, accompanied by reduced cell proliferation and altered cellular morphology. In summary, our results clearly indicate that the onset of acute pancreatitis seems to be independent of lysosomes. Neither an inhibition of a fusion of lysosomes with secretory vesicles, a distortion of lysosomal membrane integrity by the lysosomotropic substance GPN, nor an impaired transport of cathepsins from the ER to the Golgi prevented the induction of acute pancreatitis. These observations challenge the existing hypothesis that a fusion of lysosomes and zymogen granules is indispensable for the initiation of acute pancreatitis. They rather lead to the assumption that lysosomes are more likely to exert a protective role during acute pancreatitis.