Tobias Kroniger

• Bakterielle Pathogene können in ihren Wirten Infektionen auslösen, die gesundheitsgefährdend sind oder sogar zum Tod führen können. Zu diesen Pathogenen zählen auch das Gram-negative Bakterium Aeromonas salmonicida (A. salmonicida) und die Gram-positiven Bakterien Renibacterium salmoninarum (R. salmoninarum) und Streptococcus pneumoniae (S. pneumoniae). Während R. salmoninarum und A. salmonicida Fischpathogene sind, die in Salmoniden die bakterielle Nierenkrankheit (bacterial kidney disease) (BKD) (R. salmoninarum) bzw. die Fischfurunkulose (A. salmonicida) auslösen können, ist S. pneumoniae ein humaner Pathogen, der den oberen Atemwegstrakt und andere Gewebe kolonisieren und Krankheiten wie Sepsis, Meningitidis und Pneumonie auslösen kann. Gegen alle diese Pathogene existieren Vakzin-Strategien bestehend aus Kapselpolysacchariden oder inaktivierten Bakterien, um einer Infektion und deren Folgen vorzubeugen. Allerdings wirken diese Vakzine oft nur gegen bestimmte Serotypen (S. pneumoniae) oder sind mit hohem Stress und Nebenwirkungen für den Wirt verbunden (A. salmonicida, R. salmoninarum). Aus diesem Grund wird aktiv an alternativen Strategien zur Vakzinierung geforscht. Eine mögliche Route sind bakterielle Membranvesikel (MV), die sich von der bakteriellen Oberfläche Gram-positiver und Gram-negativer Bakterien abschnüren und viele potenziell immunogene Proteine auf ihrer Oberfläche tragen. In dieser Arbeit wurde das Proteinrepertoire der bakteriellen MV von R. salmoninarum, A. salmonicida und S. pneumoniae mittels Massenspektrometrie untersucht. In der aufgereinigten MV Fraktion von R. salmoninarum wurden die immunsupprimierenden Proteine P57/Msa und P22, die wichtige Virulenzfaktoren von R. salmoninarum sind, in hoher Abundanz detektiert. Weiterhin wurden neues Lipoprotein C/Protein von 60 kDa (NlpC/P60) Hydrolasen und weitere Zellwand-modifizierende Proteine in der MV Fraktion gefunden, was einen Hinweis darauf darstellen könnte, dass diese Proteinklasse eine Relevanz bei der Entstehung von MV in Gram-positiven Bakterien hat. Bei der Untersuchung der MV von A. salmonicida wurde analysiert, inwieweit sich das MV Proteinrepertoire durch Kultivierungsbedingungen beeinflussen lässt. Die MV, die unter Bedingungen mit geringer Eisenverfügbarkeit aufgereinigt wurden, hatten eine ähnliche Größe und Konzentration im Vergleich zu der Kontrollbedingung. Allerdings wurden zahlreiche Proteine in der MV Fraktion detektiert, die bei geringer Eisenverfügbarkeit signifikant in ihrer Abundanz erhöht waren. Hierzu zählten vor allem TonB-abhängige Eisen- und Siderophoretransporter, aber auch Hemolysin und Lipasen. Eine erhöhte Kultivierungstemperatur resultierte in einer geringeren Vesikelkonzentration verglichen mit der Kontrollbedingung. Allerdings führte die erhöhte Kultivierungstemperatur zu einer signifikant gesteigerten Hemolysin Abundanz. Bei der Kultivierung von A. salmonicida mit dem Antibiotika Florfenicol waren die MV in ihrer Größe deutlich verringert. Weiterhin wurden viele ribosomale Proteine in der MV Fraktion gefunden, was auf bakterielle Lyse hinweisen könnte. Der Vergleich zwischen dem Erntezeitpunkt der MV in der stationären Wachstumsphase und der Sterbephase von S. pneumoniae zeigte, dass Vesikel aus der Sterbephase im Durchschnitt leicht vergrößert und in der Konzentration 10-fach erhöht waren. Zusätzlich war Autolysin in den MV, die in der Sterbephase geerntet wurden, signifikant in der Abundanz erhöht. Zusammenfassend konnte gezeigt werden, dass sich das Proteinrepertoire der MV durch Faktoren wie die Wachstumsphase oder Kultivierungsbedingungen drastisch beeinflussen lässt. Es wurden putativ immunogene Proteine (Eisentransporter, Lipoproteine) in den MV aller untersuchten Pathogenen gefunden, was das Potenzial der MV als Vakzin-Plattform zeigt. Besonders eine Kultivierung bei Bedingungen mit geringer Eisenverfügbarkeit könnte durch die hohe Anzahl an Eisen-regulierten Membranproteinen bei einer Vakzinentwicklung von Vorteil sein.
• Bacterial pathogens can trigger infections in their hosts that can be harmful to health or even lead to death. These pathogens include the Gram-negative bacterium A. salmonicida and the Gram-positive bacteria R. salmoninarum and S. pneumoniae. While R. salmoninarum and A. salmonicida are fish pathogens that cause the bacterial kidney disease (R. salmoninarum) or furunculosis (A. salmonicida) in salmonids, S. pneumoniae can cause infections in the upper respiratory tract and other tissues of humans which can lead to sepsis, meningitidis and pneumonia. There are vaccination strategies based on polysaccharide of the capsule or inactivated bacteria to prevent an infections and its consequences. However, these vaccines are often only effective against certain serotypes (S. pneumoniae) or are associated with high stress and side effects for the host (A. salmonicida, R. salmoninarum). Because of these limitations, there are ongoing efforts to find alternative vaccination routes. One possible approach are bacterial MV which detach from the bacterial surface of Gram-positive and Gram-negative bacteria and carry many potentially immunogenic proteins on their surface. In this work, the protein repertoire of the bacterial MVs of R. salmoninarum, A. salmonicida and S. pneumoniae were analyzed by mass spectrometry. In the enriched MV fraction of R. salmoninarum the immunosuppressive proteins P57/Msa and P22, which are important virulence factors of the bacterium, were detected with high abundace. Further, NlpC/P60 hydrolases and other cell-wall modifying proteins were found in the MV fraction, indicating that this protein class may be of importance during the biogenesis of MV in Gram-positive bacteria. The analysis of the MV of A. salmonicida harvested during different cultivation conditions revealed that cultivation in an environment with low iron availability resulted in MV that have a comparable size and concentration to the control condition. However, quantitative analysis of the proteins identified in the MV of A. salmonicida showed that several proteins where significantly increased in their abundance. These proteins were mainly TonB-dependent ironand siderophore transporters, but also hemolysin and lipases were upregulated. An increased cultivation temperature lead to a lower MV concentration compared to the control condition. Hemolysin was also signficantly upregulated when the bacterium was cultivated with an increased temperature. When A. salmonicida was cultivated with the antibiotic florfenicol, the MV size was reduced drastically. Further, many ribosomal proteins were identified in the MV fraction indicating bacterial lysis. The comparison between the stationary growth phase and the death phase of S. pneumoniae revealed that vesicles harvested during the death-phase were slightly increased in size and their concentration was increased 10-fold. Additionally, autolysin was significantly increased in its abundance in MV harvest during the death phase. Taken together, this work emphasized how the MV protein repertoire is changing with external conditions like the growth phase and other cultivation conditions like iron availability, temperature and presence of an antibiotic. Several putative immunogenic proteins (iron transporters, lipoproteins) were found in the MV of all examined pathogens, showing the potential of bacterial MV as a vaccine platform. Especially the cultivation in iron-limiting conditions may be beneficial for further vaccine development efforts due to the high number of iron regulated membrane proteins.