Lisa Zierke

• Klebsiella pneumoniae (K. pneumoniae) ist ein Gram-negatives, fakultative anaerobes, stäbchenförmiges Bakterium, dass ubiquitär in der Umwelt vorkommen kann. Als human-pathogener Erreger ist es in der Lage, die humane Schleimhaut zu kolonisieren und eine Vielfalt von Infektionen auszulösen. Neben nosokomialen Infektionen, Harnwegs- und Blutbahninfektionen werden auch Lungenentzündungen verursacht. Hypervirulente Stämme zeigen einen stark mukoiden Phänotyp und können auch Weichteilinfektionen, Leberabszesse und bakterielle Meningitis verursachen. Durch die rasch steigende globale Verbreitung multiresistenter K. pneumoniae Stämme und dem gleichzeitigen Mangel von alternativen Therapieformen steigt auch die Notwendigkeit, neue Präventions- und Therapiemaßnahmen gegen eine K. pneumoniae Infektion zu entwickeln. Mögliche Präventionsmaßnahmen könnten Impfungen darstellen, die meist auf der Nutzung von Proteinen der Pathogenen basiert. Dabei sind in den letzten Jahren sowohl bei Gram-positiven Bakterien wie Streptococcus pneumoniae (S. pneumoniae), als auch Gram-negativen Bakterien wie Neisseria meningitidis (N. meningitidis) Lipoproteine, welche sich auf der bakteriellen Oberfläche befinden, in den Fokus der Impfstoff-Studien gerückt. Ob Lipoproteine auch bei K. pneumoniae einen protektiven Effekt besitzen und somit als Impfstoff-Kandidaten in Frage kommen, ist noch nicht ausreichend untersucht worden. Zu diesem Zwecke wurden in dieser Arbeit zunächst die Lipoproteine von K. pneumoniae ATCC BAA2146 (Kpn2146) in in silico Analysen identifiziert. Von den 93 potentiellen Lipoproteinen wurden 85 Kandidaten in der äußeren Membran vorhergesagt. Von den Kandidaten wurden 32 Proteine aufgrund ihrer Größe (mindestens 150 Aminosäuren) und ihrer bekannten bzw. auch ihrer unbekannten Funktion in weiterführende Studien aufgenommen. Für eine funktionelle Charakterisierung wurden auf Grundlage der Lipoprotein-kodierenden Genen und unter dem Ausschluss der für Lipoproteine charakteristischen Lipobox die Lipoproteine HP7, HslJ, LpoB, MltA, NlpD_1, NlpD_2, NlpI, Pal, QseG, RlpA, Slp und YajI heterolog in E. coli exprimiert. Die rekombinanten Proteine wurden in Immunisierungen von CD1 Mäusen zur Gewinnung von Antiseren gegen die jeweiligen Proteine und in Immunogenitätsstudien mit humanen Seren gesunder Spender und K. pneumoniae-infizierter Patienten eingesetzt. NlpD_1 und NlpD_2 zeigten immunogenes Potential. Antikörper gegen NlpD_1 und Nlp_D2 konnten sowohl in Seren gesunder Spender als auch in Seren von K. pneumoniae infizierten Patienten nachgewiesen werden. Die Oberflächenassoziation der Lipoproteine von K. pneumoniae wurde mit den anti-Lipoprotein IgGs und einer generierten unbekapselten Mutante Kpn2146Δwza in durchflusszytometrischen Analysen analysiert. Die niedrigen gemessenen Fluoreszenzintensitäten haben keinen eindeutigen Schluss auf eine Lokalisation der Lipoproteine auf der extrazellulären Bakterienoberfläche zugelassen. Für in vitro und Bindungsstudien wurde die kapsellose Mutante Kpn2146Δwza generiert. Diese Mutante wurde in der vorliegenden Arbeit auch eingesetzt, um den Einfluss der Polysaccharidkapsel auf die Adhäsion, das Überleben im Blut und die Invasivität von K. pneumoniae in einem experimentellen Infektionsmodell zu untersuchen. Die Kapsel-defiziente Mutante zeigte ein verringertes Wachstum im Komplexmedium, während es im chemisch definierten Medium keinen Wachstumsunterschied zwischen Wildtyp und der Mutante gab. Die Adhärenz der kapsellosen Mutante Kpn2146Δwza an A549 Lungenepithelzellen war identisch zum Wildtyp. Dagegen wurde eine erhöhte Internalisierung der Mutante Kpn2146Δwza im Vergleich zum Wildtyp nachgewiesen. Die Überlebensstudien von Kpn2146 und der Kapsel-defizienten Mutante in humanem Vollblut zeigten, dass die unbekapselte Mutante weder im Vollblut noch im menschlichen Plasma überleben konnte. Diese Daten wiesen darauf hin, dass die Kapsel für das Überleben, den Schutz von K. pneumoniae vor der Erkennung und Beseitigung durch das menschliche Immunsystem sowie die Komplement-vermittelte Opsonisierung und Eliminierung unerlässlich ist. Infektionen von Galleria mellonella-Larven zeigten ein deutlich verringertes Virulenzpotential der Kapsel-defizienten Mutante. Insgesamt zeigen diese Daten, dass die bakterielle Polysaccharidkapsel eine entscheidende Rolle in en Infektionen und der Immunevasion von K. pneumoniae spielt.
• Klebsiella pneumoniae (K. pneumoniae) is a Gram-negative, facultative anaerobic, rod-shaped bacterium that can occur ubiquitously in the environment. As a human-pathogenic pathogen, K. pneumoniae is able to colonize the human mucosa and causes a variety of severe infections. In addition to nosocomial, urinary tract and bloodstream infections or pneumonia, hypervirulent strains having a highly mucoid phenotype cause also soft tissue infections, liver abscesses, and bacterial meningitis. Due to the rapidly increasing global spread of multidrug-resistant K. pneumoniae strains and the simultaneous lack of alternative forms of therapy, the need to develop new preventive and therapeutic measures against K. pneumoniae infection is of utmost importance. Possible preventive measures include vaccinations, which are usually based on the use of proteinaceous immunogenic antigens of the pathogen. In recent years, lipoproteins, which are found on the bacterial surface, have become the focus of vaccine studies in both Gram-positive bacteria such as Streptococcus pneumoniae (S. pneumoniae) and Gram-negative bacteria such as Neisseria meningitidis (N. meningitidis). Whether lipoproteins also have a protective effect in K. pneumoniae and could therefore be considered as vaccine candidates has not yet been sufficiently investigated. Thus, this study initially aims to identify lipoproteins of K. pneumoniae ATCC BAA2146 (Kpn2146) in in silico approaches. Of the 93 potential lipoproteins, 85 candidates were predicted in the outer membrane, of which 32 proteins were included in further studies based on their size (at least 150 amino acids) and known or unknown function. For a functional characterization, the lipoproteins HP7, HslJ, LpoB, MltA, NlpD_1, NlpD_2, NlpI, Pal, QseG, RlpA, Slp and YajI were heterologously expressed in E. coli. The recombinant proteins were subsequently successfully used for the immunization of CD1 mice to obtain antisera against the respective proteins. The immunogenicity was tested with human sera from healthy donors and K. pneumoniae-infected patient sera. NlpD_1 and NlpD_2 emerged as potential immunogenic candidates. The surface localization of candidate lipoproteins was investigated by flow cytometry using the generated anti-lipoprotein IgGs and a onstruced nonencapsulated mutant Kpn2146Δwza.. However, the results did not allow a clear conclusion as to the surface localization of the lipoproteins on the extracellular bacterial surface. The generated capsule-deficient mutant Kpn2146Δwza was further employed to to investigate the influence of the polysaccharide capsule on bacterial adhesion to and internatlization into A549 lung epithelial cell as well as to assess survival in the blood and invasiveness of K. pneumoniae in an experimental infection model. The capsule-deficient mutant showed reduced growth in complex medium, whereas there was no difference in growth behaviour between the wild-type and Kpn2146Δwza in the chemically defined medium. Likewise, no difference in adhesion was evident between wild-type and capsule-less mutant, whereas internalization data showed a moderately higher invasion of Kpn2146Δwza compared to the wild-type. The results of the comparative survival studies in human whole blood showed that the nonencapsulated mutant could neither survive in whole blood nor in human plasma. These data indicated that the capsule is essential for survival, protection of K. pneumoniae from recognition and clearance by the human immune system, and complement-mediated opsonization and killing as well. Infections of Galleria mellonella larvae showed a significantly reduced virulence potential of the capsule-deficient mutant. Overall, these data show that the bacterial polysaccharide capsule plays a crucial role in vivo.