Eva-Carina Wendegatz

• Die Dynamik der eukaryotischen Chromatinstruktur beeinflusst maßgeblich die Zugänglichkeit der DNA für die Transkriptionsmaschinerie, wobei Histone und DNA entweder direkt chemisch modifiziert werden oder die Position und Zusammensetzung der Nukleosomen moduliert wird. Chromatinremodellierungskomplexe wie SWI/SNF, RSC und INO80 sind für die Umstrukturierung des Chromatins verantwortlich, da sie ATP-abhängig Nukleosomen repositionieren und dadurch Promotorregionen zugänglich machen, sodass Transkriptionsstartstellen freigelegt werden, welche für die Initiierung der Transkription essenziell sind. Sie stehen dabei in direktem Kontakt mit den Transkriptionsaktivierungsdomänen (TADs) transkriptioneller Aktivatoren, wodurch es den Chromatinremodellierungskomplexen möglich ist, die Transkription spezifischer Gene über das Verschieben von Nukleosomen oder den Austausch von Histonvarianten zu regulieren. In dieser Arbeit wurde das komplexe Wechselwirken verschiedener Chromatinremodellierungskomplexe mit transkriptionellen Aktivatoren der Hefe Saccharomyces cerevisiae untersucht. Dabei standen insbesondere der Aktivator der Phospholipid-Biosynthese Ino2 und das humane Protoonkoprotein c-Myc im Fokus. Die beiden Aktivatoren ähneln sich in ihrer Struktur und sind zur DNA-Bindung auf ihre jeweiligen Partner Ino4 bzw. Max angewiesen. Es wurde gezeigt, dass der transkriptionelle Säuger-Aktivator c-Myc über seine beiden N-terminalen TADs auch Kontakt zu zahlreichen Coaktivatoren der Hefe aufnehmen kann. Obwohl c-Myc/Max eine signifikante Genaktivierung durch die Ino2/Ino4-Bindestelle ICRE („inositol/choline response element“) vermitteln kann, reicht diese nicht aus, um einen Verlust vonIno2/Ino4 in der Hefe zu kompensieren, trotz der Interaktion mit Hefe-Coaktivatoren. In dieser Arbeit wurde durch affinitätschromatographische GST-„Pulldown“ Untersuchungen gezeigt, dass sowohl die ATPase Swi2 als auch die Untereinheiten Swi1, Snf5 und Snf6 des Chromatinremodellierungskomplexes SWI/SNF mit beiden TADs von Ino2 wechselwirken können. Für Swi1, Swi2 und Snf5 wurden Aktivatorbindedomänen (ABDs) präzise kartiert. Diese redundanten Interaktionen erklären, weshalb die Deletion der ABD von Swi2 zu keinem Funktionsverlust des Komplexes führt. Ferner wurde durch Chromatin-Immunopräzipitation (ChIP) gezeigt, dass Swi2 in Abhängigkeit des Aktivators Ino2 an ICRE-haltigen Promotoren vorliegt. Da auch die Chromatinremodellierungskomplexe RSC und INO80 in der Lage sind, Nukleosomen zu verschieben, wurden etwaige Aktivatorkontakte der entsprechenden ATPasen Sth1 und Ino80 in dieser Arbeit genauer betrachtet. Für beide ATPasen konnten Kontakte zu Ino2 sowie zu weiteren Aktivatoren nachgewiesen und die verantwortliche ABD kartiert werden. Deletionsstudien zeigten, dass die ABDs beider ATPasen für die biologische Funktion der jeweiligen Komplexe essentiell sind, wenngleich nicht völlig ausgeschlossen ist, dass die Funktionsverluste auf fehlerhafter Assemblierung der Komplexe beruhen. Für Sth1 konnte durch den Austausch evolutionär konservierter basisch/hydrophober Aminosäuren ein ABD-Kernbereich identifiziert werden, der für die Funktion des Komplexes in vivo und in vitro essentiell ist. Bei Ino80 könnte der Funktionsverlust zudem auf die Überlappung seiner ABD mit anderen funktionellen Domänen (Bindung an DNA bzw. Actin) zurückzuführen sein. Neben der Chromatinremodellierung ist auch die Modifizierung der Histone, z. B. die Histonacetylierung durch die Komplexe SAGA oder NuA4, ein zentraler Aspekt der Chromatindynamik. In dieser Arbeit wurde daher auch die Bindung von Ino2 an die strukturgebende Untereinheit Tra1 von SAGA und NuA4 untersucht. Tra1 ist in der Lage, über eine Solenoid-Struktur seiner repetitiv aufgebauten HEAT-Domäne Aktivatoren zu binden. Es wurde gezeigt, dass auch Ino2 an diese HEAT-Domäne bindet. Im Gegensatz zur Aktivatorbindung von Chromatinremodellierungskomplexen ist diese jedoch keiner spezifischen ABD im klassischen Sinne zuzuordnen, sondern stattdessen von einer Mindestanzahl an Repetitionen abhängig. Die HEAT-Domäne könnte daher als universelle Plattform für Aktivatorkontakte fungieren. Diese Arbeit beleuchtet die vielfältigen Interaktionen zwischen genspezifischen Transkriptions-faktoren und Coaktivatoren. Es wurde gezeigt, dass Ino2 über seine TADs sowohl die ATPasen verschiedener Chromatinremodellierungskomplexe als auch weitere Untereinheiten des SWI/SNF-Komplexes binden kann, während andere Transkriptionsfaktoren ihre Bindungspartner mannigfaltig variieren. Ferner zeigt diese Arbeit, dass saure TADs auch artübergreifend mit Coaktivatoren interagieren können, was auf flexible Bindungsmechanismen und variable Konformationszustände der TADs hinweist. Diskutiert wird derzeit, welche strukturellen und biochemischen Eigenschaften der TADs ihren Bindungscharakter bestimmen. Insgesamt unterstreicht diese Arbeit die hohe Plastizität der TADs sowie ihr vielgestaltiges Wechselwirken mit den ABDs der Coaktivatoren, was für die Regulation der Genexpression entscheidend ist.
• The dynamics of eukaryotic chromatin structure significantly affects the accessibility of DNA for the transcriptional machinery. Histones and DNA can be either chemically modified or position and composition of nucleosomes may be modulated. Chromatin remodelling complexes such as SWI/SNF, RSC and INO80 are responsible for chromatin restructuring by ATP-dependent repositioning of nucleosomes, thereby making promoter regions accessible and exposing transcriptional start sites which are essential for the initiation of transcription. These complexes directly interact with transcriptional activation domains (TADs) of transcriptional activators, allowing them to regulate the transcription of specific genes by shifting nucleosomes or exchanging histone variants. This study investigated the complex interactions of various chromatin remodelling complexes with transcriptional activators in the yeast Saccharomyces cerevisiae. Particular attention was given to the phospholipid biosynthetic activator Ino2 and the human proto-oncogene c-Myc. These two activators are structurally similar and rely on their respective partners, Ino4 and Max, for DNA binding. It was demonstrated that two N-terminal TADs of mammalian activator c-Myc can also interact with yeast-specific coactivators. Although c-Myc/Max mediatessubstantial gene activation in yeast via the ICRE motif (inositol/choline response element) asthe binding site of Ino2/Ino4 and despite c-Myc interaction with yeast coactivators, bothmammalian proteins are unable to compensate for a loss of Ino2/Ino4. Affinity chromatographic GST-pulldown studies performed in this work could demonstrate that the ATPase Swi2 as well as subunits Swi1, Snf5 and Snf6 of the chromatin remodelling complex SWI/SNF interact with both TADs of Ino2. Activator binding domains (ABDs) were precisely mapped for Swi1, Swi2 and Snf5. Such redundant interactions explain why SWI/SNF is still functional after deletion of the Swi2 ABD. Chromatin immunoprecipitation (ChIP) experiments finally revealed Ino2-dependent recruitment of ATPase Swi2 to ICRE-containing promoters. Since chromatin remodelling complexes RSC and INO80 can also relocate nucleosomes, activator binding of the respective ATPases Sth1 and Ino80 was investigated in detail. Both ATPases could indeed contact Ino2 as well as additional unrelated activators and ABDs were mapped in both proteins. Deletion studies provided strong evidence that the ABDs of both ATPases are essential for the biological function of the respective complex. However, it cannot be excluded that the loss of function is due to faulty assembly of the complex. For Sth1, a core region of the ABD essential for the function of the complex in vivo and in vitro was identified by site-directed exchange of evolutionary conserved basic/hydrophobic amino acids. For Ino80, the essential function of the ABD can be also explained by its overlap with distinct functional domains responsible for DNA binding or contacting actin. In addition to chromatin remodelling, histone modification (such as histone acetylation by complexes SAGA or NuA4) is also an important aspect of chromatin dynamics. Therefore, the binding of Ino2 to the structural subunit Tra1 of SAGA and NuA4 was also investigated in this work. Tra1 can bind activators via a solenoid structure of its repetitive HEAT domain. It could be shown that Ino2 also binds to this HEAT domain. Unlike the activator binding of chromatin remodelling complexes, this binding is not attributed to a specific ABD in the classical sense but depends on a specific number of repeats. The HEAT domain may therefore act as a universal platform for activator contacts. This study highlights the various interactions between gene-specific transcription factors and coactivators. It was shown that TADs of Ino2 can bind ATPases of various chromatin remodelling complexes as well as different subunits of the SWI/SNF complex, while other transcription factors vary their binding partners. Furthermore, this study demonstrates that acidic TADs can interact with coactivators across species, indicating flexible binding mechanisms and variable conformational states of TADs. The structural and biochemical properties of TADs determining their binding characteristics are currently being discussed. Overall, this work underscores the high plasticity of TADs and their diverse interactions with coactivators which are crucial for the regulation of gene expression.