Thaleia Sakoleva

• This thesis aimed at the identification, engineering, and application of NAD(P)H dependent oxidoreductases such as Baeyer-Villiger monooxygenases (BVMOs) and enoate reductases (EREDs) due to their importance as biocatalysts in the chemical and pharmaceutical industry. To facilitate the implementation of biocatalysis in industrial processes, improved co-factor regeneration strategies as well as tools for the high-throughput characterization of enzymes are greatly demanded. Therefore, the combination of target biocatalytic reactions with the direct electrochemical regeneration of NAD(P)H co-factors have been investigated herein. Furthermore, the bioinformatic-assisted identification of novel oxidoreductases and their tailoring by protein engineering not only expands the number of available enzymes, the presented biocatalysis-based strategies offer promising alternatives to established chemical reaction schemes that are compliant with ‘The 12 Principles of Green Chemistry’. In Article I, the direct electrochemical NADH regeneration was explored on the cathode of a carbon electrode, modified with Toray paper sprayed with carbon nanoparticles. The nicotinamide product distribution was investigated and the electrochemical flow cell reactor was combined with an enzymatic reduction reaction to validate the method. Article II focuses on the discovery and characterization of BVMOs, through the bioinformatic analysis of sequence similarity networks (SSNs). An uncharacterized BVMO from Halopolyspora algeriensis (BVMOHalo) was identified after in silico clustering of protein sequences and characterized biochemically (e.g., pH optimum, organic solvent tolerance). Substrate scope elucidation enabled the annotation of BVMOHalo as aliphatic ketone monooxygenase. Expanding from the findings in Article II, Article III features the first genetically encoded biosensor system to monitor BVMO activity. This biosensor implementation accelerated the screening of a focused library of active site mutants of BVMOHalo and the identification of ester forming variants, overcoming the low-throughput analysis of BVMO reaction products by chromatographic methods. Together, the presented articles address key challenges in biocatalysis, ranging from the recycling of co-factors and the identification and evolution of novel enzymes. Article I: Product distribution of steady-state and pulsed electrochemical regeneration of 1,4-NADH and integration with enzymatic reaction Mohammed Ali Saif Al-Shaibani , Thaleia Sakoleva , Luka A. Živković, Harry P. Austin , Mark Dörr , Liane Hilfert , Edgar Haak, Uwe T. Bornscheuer, Tanja Vidaković-Koch, ChemistryOpen, 2024, e202400064 This article describes the direct electrochemical regeneration of NADH on carbon electrodes, modified with carbon nanoparticles sprayed Toray paper. The product distribution under steady-state and dynamic conditions was investigated and proved that the dynamic operation offered a faster mode, yielding the desired 1,4-NADH isomer. In parallel, side products such as different NAD dimers, the enzymatically inactive isomer 1,6-NADH, and the formation of ADP-ribose represent disadvantages of the investigated electrochemical co-factor recycling method. In addition to this, the different nicotinamide side products are enzymatic inhibitors, negatively impacting product yields. Article II: Discovery and characterization of a Baeyer-Villiger monooxygenase using sequence similarity network analysis Thaleia Sakoleva, Harry P. Austin, Chrysoula Tzima, Mark Dörr, Uwe T. Bornscheuer, ChemBioChem, 2023, e202200746 This article describes the discovery of the novel BVMOHalo by SSN analysis. The sequence was retrieved after protein clustering. The enzyme was successfully expressed in Escherichia coli (E. coli) and purified. Substrate scope investigation suggested that BVMOHalo prefers linear aliphatic ketones. Optimal reaction conditions were determined in different buffer systems at varying pH, temperatures, and in the presence of commonly used organic co-solvents. Finally, the enzyme remained stable after five days of storage, which is remarkable since BVMOs regularly suffer from short half-lives. Article III: Biosensor-guided engineering of a Baeyer-Villiger monooxygenase for aliphatic ester production Thaleia Sakoleva, Florian Vesenmaier, Lena Koch, Jarne E. Schunke, Kay Novak, Sascha Grobe, Mark Dörr, Uwe T. Bornscheuer, Thomas Bayer, ChemBioChem, e202400712. This article describes the engineering of the catalytic site of BVMOHalo and the detection of active variants using a bioluminescence-based assay. Aliphatic ketones were converted into the corresponding esters by this BVMO. Subsequently, esters are transformed through an artificial enzyme cascade, consisting of an esterase and an alcohol dehydrogenase (ADH), yielding aldehydes as cascade products. The aldehyde is then substrate for a bacterial luciferase (LuxAB), which emits light through the oxidation of aldehydes to the corresponding carboxylates. This biosensor setup was used to guide the selection of ester-forming variants of BVMOHalo – not only representing the first genetically encoded biosensor system to monitor the product formation in BVMO-catalyzed reactions but offering great potential to accelerate protein and metabolic engineering campaigns in the future.
• Ziel dieser Arbeit war die Identifizierung, Entwicklung und Anwendung von NAD(P)H-abhängigen Oxidoreduktasen wie Baeyer-Villiger-Monooxygenasen (BVMOs) und Enoatreduktasen (EREDs) aufgrund ihrer Bedeutung als Biokatalysatoren in der chemischen und pharmazeutischen Industrie. Um die Implementierung der Biokatalyse in industrielle Prozesse zu erleichtern, besteht ein großer Bedarf an verbesserten Strategien zur Regeneration von Cofaktoren sowie an Werkzeugen zur Hochdurchsatzcharakterisierung von Enzymen. Daher wurde hier die Kombination gezielter biokatalytischer Reaktionen mit der direkten elektrochemischen Regeneration von NAD(P)H-Cofaktoren untersucht. Darüber hinaus erweitert die bioinformatisch unterstützte Identifizierung neuer Oxidoreduktasen und ihre Anpassung durch Protein-Engineering nicht nur die Anzahl der verfügbaren Enzyme, sondern die vorgestellten biokatalysebasierten Strategien bieten vielversprechende Alternativen zu etablierten chemischen Reaktionsschemata, die den „12 Prinzipien der Grünen Chemie“ entsprechen. In Artikel I wurde die direkte elektrochemische NADH-Regeneration an der Kathode einer Kohlenstoffelektrode untersucht, die mit mit Kohlenstoffnanopartikeln besprühtem Toray-Papier modifiziert wurde. Die Verteilung des Nicotinamidprodukts wurde untersucht und der elektrochemische Durchflusszellenreaktor wurde mit einer enzymatischen Reduktionsreaktion kombiniert, um die Methode zu validieren. Artikel II konzentriert sich auf die Entdeckung und Charakterisierung von BVMOs durch die bioinformatische Analyse von Sequenzähnlichkeitsnetzwerken (SSNs). Ein nicht charakterisiertes BVMO aus Halopolyspora algeriensis (BVMOHalo) wurde nach In-silico-Clusterbildung von Proteinsequenzen identifiziert und biochemisch charakterisiert (z. B. pH-Optimum, Toleranz gegenüber organischen Lösungsmitteln). Die Aufklärung des Substratumfangs ermöglichte die Annotation von BVMOHalo als aliphatische Ketonmonooxygenase. Aufbauend auf den Erkenntnissen aus Artikel II präsentiert Artikel III das erste genetisch kodierte Biosensorsystem zur Überwachung der BVMO-Aktivität. Diese Biosensor-Implementierung beschleunigte das Screening einer fokussierten Bibliothek aktiver Mutanten von BVMOHalo und die Identifizierung esterbildender Varianten, wodurch die Niedrigdurchsatzanalyse von BVMO-Reaktionsprodukten mit chromatographischen Methoden überwunden wurde. Gemeinsam befassen sich die vorgestellten Artikel mit den wichtigsten Herausforderungen der Biokatalyse, angefangen beim Recycling von Cofaktoren bis hin zur Identifizierung und Entwicklung neuer Enzyme. Artikel I: Produktverteilung der stationären und gepulsten elektrochemischen Regeneration von 1,4-NADH und Integration mit enzymatischen Reaktionen Mohammed Ali Saif Al-Shaibani, Thaleia Sakoleva, Luka A. Živković, Harry P. Austin, Mark Dörr, Liane Hilfert, Edgar Haak, Uwe T. Bornscheuer, Tanja Vidaković-Koch, ChemistryOpen, 2024, e202400064 Dieser Artikel beschreibt die direkte elektrochemische Regeneration von NADH auf Kohlenstoffelektroden, die mit mit Kohlenstoffnanopartikeln besprühtem Toray-Papier modifiziert wurden. Die Produktverteilung unter stationären und dynamischen Bedingungen wurde untersucht und es wurde nachgewiesen, dass der dynamische Betrieb einen schnelleren Modus bietet, der das gewünschte 1,4-NADH-Isomer ergibt. Parallel dazu stellen Nebenprodukte wie verschiedene NAD-Dimere, das enzymatisch inaktive Isomer 1,6-NADH und die Bildung von ADP-Ribose Nachteile der untersuchten elektrochemischen Cofaktor-Recyclingmethode dar. Darüber hinaus sind die verschiedenen Nicotinamid-Nebenprodukte enzymatische Inhibitoren, die sich negativ auf die Produktausbeute auswirken. Artikel II: Entdeckung und Charakterisierung einer Baeyer-Villiger-Monooxygenase mittels Sequenzähnlichkeitsnetzwerkanalyse Thaleia Sakoleva, Harry P. Austin, Chrysoula Tzima, Mark Dörr, Uwe T. Bornscheuer, ChemBioChem, 2023, e202200746 Dieser Artikel beschreibt die Entdeckung des neuen BVMOHalo durch SSN-Analyse. Die Sequenz wurde nach Proteinclusterung abgerufen. Das Enzym wurde erfolgreich in Escherichia coli (E. coli) exprimiert und gereinigt. Untersuchungen des Substratumfangs ergaben, dass BVMOHalo lineare aliphatische Ketone bevorzugt. Optimale Reaktionsbedingungen wurden in verschiedenen Puffersystemen bei unterschiedlichem pH-Wert, unterschiedlichen Temperaturen und in Gegenwart häufig verwendeter organischer Co-Lösungsmittel ermittelt. Schließlich blieb das Enzym nach fünf Tagen Lagerung stabil, was bemerkenswert ist, da BVMOs regelmäßig unter kurzen Halbwertszeiten leiden. Artikel III: Biosensorgesteuerte Entwicklung einer Baeyer-Villiger-Monooxygenase zur Produktion aliphatischer Ester Thaleia Sakoleva, Florian Vesenmaier, Lena Koch, Jarne E. Schunke, Kay Novak, Sascha Grobe, Mark Dörr, Uwe T. Bornscheuer, Thomas Bayer, ChemBioChem, e202400712 Dieser Artikel beschreibt die Entwicklung der katalytischen Stelle von BVMOHalo und die Erkennung aktiver Varianten mithilfe eines auf Biolumineszenz basierenden Tests. Aliphatische Ketone wurden durch dieses BVMO in die entsprechenden Ester umgewandelt. Anschließend werden die Ester durch eine künstliche Enzymkaskade, bestehend aus einer Esterase und einer Alkoholdehydrogenase (ADH), umgewandelt, wodurch Aldehyde als Kaskadenprodukte entstehen. Der Aldehyd ist dann Substrat für eine bakterielle Luciferase (LuxAB), die durch die Oxidation von Aldehyden zu den entsprechenden Carboxylaten Licht emittiert. Dieser Biosensor-Aufbau wurde zur Auswahl der esterbildenden Varianten von BVMOHalo verwendet. Er stellt nicht nur das erste genetisch kodierte Biosensorsystem zur Überwachung der Produktbildung in BVMO-katalysierten Reaktionen dar, sondern bietet auch großes Potenzial zur Beschleunigung zukünftiger Protein- und Stoffwechseltechnikkampagnen.