Marcel Fabian Welle

• Hypoxic environmental conditions such as flooding and the resulting oxygen limitation for plant roots interrupt oxidative phosphorylation and lead to an energy crisis in plants. The energy shortage eventually results in the breakdown of cellular transmembrane gradients and cell death. The degradation of sucrose and starch and an increase in anaerobic glycolysis are well-described mechanisms to provide energy and survive this crisis. Lactic acid and ethanolic fermentation recycle reducing equivalents to maintain ATP synthesis. However, alternative reducing equivalent oxidation mechanisms (Chapter I), alternative energy and carbon sources (Chapter II) and regulation of energy consumption (Chapter III) can be crucial for survival under low oxygen conditions. To answer this hypothesis, emissions of nitric oxide (NO) under low-oxygen conditions (mechanism – Chapter I), changes in lipid composition under hypoxic conditions (energy source – Chapter II) and a redox-reactive and highly conserved cysteine residue of a plasma membrane (PM) P-type H+-ATPase (energy consumption – Chapter III) were investigated. The thesis confirmed the importance of nitrite (NO2-) as an alternative electron acceptor resulting in NO emissions of plant roots during low-oxygen stress. Firstly, the chemiluminescence-based detection of oxygen-dependent NO emissions in in vivo studies for roots of tomato, barley and tobacco is reported using a root reactor (Chapter I). The large amounts of low-oxygen NO emission in the root reactor suggest a role in generation of ATP. NO2- reduction appears to be involved in the mitochondrial electron transfer chain (mETC) and therefore may contribute to ATP generation. In response to oxygen depletion, an escape strategy of the studied species seems likely, including oxygen supply systems. In this strategy, additional ATP is invested to integrate structural changes. However, hypoxic tomato plants seem to rely on glycolysis and fermentation. They do not utilize lipid degradation and β-oxidation as energy source which was confirmed in HPLC-MS-MS analysis studies of hypoxic tomato roots (Chapter II). In terms of energy source, neither a depletion of lipids nor an increase in lipid degradation was observed. Triacylglycerol (TG) was more abundant and the degree of unsaturation of fatty acids increased due to hypoxic conditions (Chapter II). TGs play a role as intermediates in lipid metabolism. Subsequent utilization of carbon and energy sources during prolonged oxygen scarcity is possible. However, an altered activity of PM P-type H+-ATPase due to hypoxic-induced, posttranslational NO modification was not confirmed. A possible S-nitrosylation site at the conserved cysteine residue was not verified in the biochemical mutagenesis study described in Chapter III. Regulation of PM P-type H+-ATPase activity via cytoplasmatic ATP-level may be possible in plants. The maintenance of proteins and cell functions appears to be essential under conditions of low-oxygen and high levels of reactive nitrogen species (RNS) such as NO (Chapter I). The induction of antioxidant systems under low-oxygen stress is well known. In this thesis, the highly conserved cysteine near the P-site of the PM P-type H+-ATPase was shown to act as an endogenous antioxidant (Chapter III). This underlines the importance of this enzyme for the cell. While the changes in lipid composition observed under hypoxia highlight the importance of maintaining membrane integrity and fluidity as in the case of plastids (Chapter II). Membrane adaptation results in increased TG abundance which led to the formation of lipid droplets. TG may scavenge toxic intermediates to prevent cell death. Lipid droplets provide a binding site for enzymes involved in adaptation and may even protect unsaturated fatty acids under high reactive oxygen species (ROS) and RNS environments by being incorporated into their core. Under low-oxygen conditions, various strategies have evolved to provide sufficient energy for adaptation and survival while protecting vital cellular functions in plants. The increase in flooding and heavy rainfall due to climate change poses a challenge to crops and their harvest. Plant-based stress-responses may even be a factor impacting the climate (Chapter I). In order to stabilize food production, plant breeding may need to rethink breading strategies in certain areas. With more heavy rains and same annual rain fall a quiescence strategy via growth retention may sometimes be better than an escape strategy to save crucial energy under time-limited stress conditions. A better understanding of survival mechanisms, as provided in this thesis, may help to develop strategies that strengthen plants under mild low-oxygen conditions.
• Hypoxische Umweltbedingungen wie Überschwemmungen und die daraus resultierende Sauerstofflimitierung im Wurzelbereich beeinträchtigen die oxidative Phosphorylierung. Die so entstehende Energiekrise in der Pflanze führt, wenn nicht behoben, zum Zusammenbruch der zellulären Transmembrangradienten und schlussendlich zum Zelltod. Ein erhöhter Saccharose - und Stärkeabbau sowie ein Anstieg der anaeroben Glykolyse stellen die benötigte Energie zum Überwinden der Energiekrise bereit. Hierbei recyclen Milchsäure - und alkoholische Fermentation Reduktionsäquivalente, um die ATP-Synthese aufrechtzuerhalten. Allerdings können alternative NADH-Oxidationsmechanismen (Kapitel I), alternative Energie- und Kohlenstoffquellen (Kapitel II) und die Regulierung des Energieverbrauchs (Kapitel III) für das Überleben unter sauerstofflimitierenden Bedingungen entscheidend sein. Um diese Hypothese zu beantworten, wurde die Emission von Stickstoffmonoxid (NO) unter sauerstoffarmen Bedingungen (Mechanismus - Kapitel I), die Lipidzusammensetzung unter hypoxischen Bedingungen (Energiequelle - Kapitel II) und ein redoxaktive und hochkonservierte Cysteingruppe einer Plasmamembran (PM) P-Typ H+-ATPase (Energieverbrauch - Kapitel III) untersucht. Diese Dissertation bestätigt die Relevanz Nitrits (NO2-) als alternativem Elektronenakzeptor unter hypoxischem Stress und der resultierenden Emission von NO in der Pflanzenwurzel. Erstmalig werden sauerstoffabhängigen NO-Emissionen in In-vivo-Studien an Wurzeln von Tomaten, Gerste und Tabak mittels Chemilumineszenzdetektion nachgewiesen (Kapitel I). Die Quantität der hypoxiebedingten NO-Emissionen im Wurzelreaktor lassen auf eine Beteiligung an der ATP-Erzeugung schließen. Die beobachtete NO2- Reduktion scheint hauptsächlich mitochondrialen Ursprungs zu sein (Kapitel I). Als Reaktion auf Sauerstoffmangel scheinen die untersuchten Arten eine Ausweichstrategie, unter Aufbau eines alternativen Sauerstoffversorgungssysteme zu verfolgen. Bei dieser Strategie wird zusätzliches ATP investiert, um strukturelle Veränderungen zu realisieren. Hierzu setzten hypoxische Tomatenpflanzen auf Glykolyse und Fermentation. Lipidabbau und β-Oxidation spielen, wie mittels HPLC-MS-MS gezeigt, bei hypoxischen Tomatenwurzeln eine untergeordnete Rolle in der Energiegewinnung (Kapitel II). So wurde weder eine Reduktion der Gesamtlipide noch eine Induktion des Lipidabbaus beobachtet. Sowohl Triacylglycerin (TG) als auch ungesättigten Fettsäuen waren unter hypoxischen Bedingungen abundanter (Kapitel II). TGs sind wichtige Zwischenprodukte im Lipidstoffwechsel. Eine spätere Verwertung als Kohlenstoff- und Energielieferant bei langanhaltender Sauerstoffknappheit ist möglich. Abschließend konnte der Einfluss hypoxisch induzierten, posttranslationalen NO-Modifikation auf die Aktivität der PM P-Typ H+-ATPase nicht bestätigt werden. Eine mögliche S-Nitrosylierungsstelle an einer konservierten Cysteingruppe wurde in einer biochemischen Mutagenesestudie nicht verifiziert (Kapitel III). Eine Regulierung der PM P-Typ H+-ATPase-Aktivität über das zytoplasmatische ATP-Level unter hypoxischen Bedingungen in der Pflanze ist jedoch möglich. Die Aufrechterhaltung von Protein - und Zellfunktionen scheint unter sauerstofflimitierenden Bedingungen und bei hohen Konzentrationen reaktiver Stickstoffspezies (RNS) wie NO jedoch von wesentlicher Bedeutung zu sein (Kapitel I). Die Induktion der antioxidativen Systeme unter hypoxischen Bedingungen ist bekannt. Diese Arbeit identifizierte das hochkonservierte Cystein in der Nähe der P-site der PM P-Typ H+-ATPase als endogenes Antioxidans (Kapitel III). Dies unterstreicht die Bedeutung dieses Enzyms für die Zelle. Während hypoxischen Veränderungen der Lipidzusammensetzung die Wichtigkeit von Membranintegrität und - fluidität, im Besonderen der Plastiden, hervorheben (Kapitel II). Die durch die Membrananpassungen akkumulierten TGs wiederrum bilden Lipidkörper. TGs können toxische Zwischenprodukte abfangen und so den Zelltod verhindern. Lipidkörper fungieren aber auch als Bindestelle für in der Stressadaption involvierten Enzyme. Zusätzlich könnten Lipidkörper durch deren Einlagerung im Inneren ungesättigte Fettsäuren vor reaktiven Sauerstoffspezies (ROS) und RNS schützen. Unter sauerstofflimitierenden Bedingungen haben sich verschiedene Strategien zur Energieversorgung in Pflanzen entwickelt. Diese stellen nicht nur die nötige Energie für Anpassungen und das Überleben bereit, sondern schützen gleichzeitig lebenswichtige Zellfunktionen. Zum einen stellt die Zunahme von Überschwemmungen und starken Regenfällen aufgrund des Klimawandels eine enorme Herausforderung für die Pflanzen an sich und deren Ertrag dar. Auf der anderen Seite können die pflanzlichen Stressadaptionen selbst ein klimabeeinflussender Faktor sein (Kapitel I). Bei häufigeren Starkregenereignisse und gleicher jährlicher Gesamtregenmenge muss möglicherweise die Züchtungsstrategie überdacht werden um die Nahrungsproduktion sicherzustellen. Eine Wachstumspause mag unter kurzen aber intensiven abiotischen Bedingungen vorteilhafter denn ein Entwachsen des Stresses sein. Ein besseres Verständnis der Überlebensmechanismen, wie in dieser Arbeit präsentiert, kann dazu beitragen, diese Strategien zu identifizieren und somit Pflanzen unter sauerstofflimitierenden Bedingungen widerstandsfähiger machen.