Justus Leopold

• Die Behandlung von Hochrisiko-Neuroblastom-Patienten mit dem Anti-GD2-Antikörper (AK) Dinutuximab beta (DB) hat das Überleben der Patienten um 15% verbessert. Die AK-abhängige zelluläre Zytotoxizität (ADCC) ist der wichtigste Wirkmechanismus und wird hauptsächlich durch NK-Zellen vermittelt. Die gleichzeitige Behandlung mit IL-2 zeigte keinen zusätzlichen klinischen Nutzen, wahrscheinlich auf Grund einer starken Induktion immuninhibierender Treg. Daher untersuchten wir hier eine DB-basierte Immuntherapie in Kombination mit dem Immunzytokin FAP-IL-2v, welches aus einem fibroblast-activation-protein-α (FAP)-spezifischen AK besteht, der mit einer mutierten IL- 2-Variante (IL-2v) verknüpft ist. Das mutierte IL-2v hat eine aufgehobene Bindung des hochaffinen IL-2-Rezeptors, wodurch NK-Zellen ohne Induktion von Treg stimuliert werden. Die Auswirkungen von FAP-IL-2v auf NK-Zellen, Treg und die DB vermittelte ADCC, sowie die FAP-Expression in NB wurden mittels RT-PCR-Analyse, Durchflusszytometrie und einem Calcein-AM-basierten Zytotoxizitätstest untersucht. Darüber hinaus wurde der Einfluss von löslichen Faktoren, die von Tumorzellen sezerniert werden, auf die FAP-Expression durch primäre Fibroblasten untersucht. Schließlich wurde eine kombinierte Immuntherapie mit DB und FAP-IL-2v in einem resistenten syngenen murinen NB-Modell untersucht. Die Inkubation von Leukozyten mit FAP-IL-2v verstärkte die DB-spezifische ADCC ohne Induktion von Treg. Ebenso gelang es eine FAP-Expression durch humane NB-Zellen und myeloid-derived suppressor cells (MDSC) im murinen Tumorgewebe nachzuweisen. Des Weiteren konnte eine tumorzellabhängige Verstärkung der FAP-Expression durch primäre Fibroblasten nachgewiesen werden. Anschließend konnte in vivo bewiesen werden, dass die Kombination von DB mit FAP-IL-2v zu einem stark verringerten Tumorwachstum und einer deutlich verbesserten Überlebensrate der behandelten Mäuse führt. Im Tumorgewebe zeigte sich eine vermehrte Tumorinfiltration durch NK-Zellen und zytotoxische T-Zellen sowie eine geringere Anzahl von Treg im Vergleich zu den Kontrollen. Zusammenfassend belegen unsere Daten, dass FAP-IL-2v die Wirksamkeit von DB gegen NB verstärkt und eine vielversprechende Alternative zu IL-2 darstellt.
• Treatment of high-risk neuroblastoma patients with the anti-GD2 antibody (ab) dinutuximab beta (DB) has improved patient survival by 15%. Ab-dependent cellular cytotoxicity (ADCC) is the main mechanism of action and is mainly mediated by NK cells. Concomitant treatment with IL-2 showed no additional therapeutic benefit, probably due to a strong induction of immunoinhibitory Treg. Therefore, we investigated here whether an additional treatment of NB with FAP-IL-2v improves antitumor efficacy of DB-based immunotherapy. The mutant IL-2v has an abolished binding to the high-affinity IL-2 receptor and stimulates NK cells without induction of Treg. The effects of FAP-IL-2v on NK cells, Treg and DB-mediated ADCC as well as FAP expression in NB were investigated by RT-PCR analysis, flow cytometry and a calcein-AM-based cytotoxicity assay. In addition, the influence of soluble factors secreted by tumor cells on FAP expression by primary fibroblasts was investigated. Finally, combined immunotherapy with DB and FAP-IL-2v was investigated in a resistant syngeneic murine NB model. Our results show that incubation of leukocytes with FAP-IL-2v results in a clear enhancement of DB-specific ADCC. Importantly, in contrast to IL-2, treatment of leukocytes with FAP-IL-2v did not result in induction of Treg. Next, analysis of human NB cells and myeloid-derived suppressor cells (MDSC) showed FAP-expression by these cells. A tumor cell-dependent enhancement of FAP expression by primary fibroblasts was demonstrated. In the next step, combinatorial treatment of murine high-risk neuroblastoma with DB and FAP-IL-2v was tested in vivo. We found that additional treatment of tumor bearing mice with FAP-IL-2v strongly increased antitumor efficacy of DB showing a reduction in tumor burden and significantly improved EFS. Finally, analysis of tumor tissue showed increased tumor infiltration by NK cells and cytotoxic T cells as well as reduced numbers of Treg compared to controls treated with either DB, IL-2 or a combination thereof. Together, our data show a significant improvement of antitumor effects of DB by addition of FAP-IL-2v, thus suggesting FAP-IL-2v as a promising alternative to IL-2.