Fabian Stei

• Mycobacterium tuberculosis (Mtb) poses a significant global health threat, necessitating the identification of protective immune responses across various host species to facilitate eradication efforts through novel vaccine strategies. While it is known that secretion of the cytokine interferon-gamma (IFNγ) by T cells is a primary anti-mycobacterial response across mammals with varying susceptibility to Mtb, knowledge about the downstream effects of IFNγ on macrophages from natural hosts and species-specific differences is incomplete. In this study, we systematically compared the IFNγ-mediated protection by primary macrophages from humans, cattle, and mice against Mtb. Utilizing Mtb growth assays, high-content microscopy, functional assays, RNAseq, and qPCR, we elucidated the similarities and differences in protective immune responses. Our findings reveal that under comparable culture conditions, IFNγ induced a pro-inflammatory CXCL10-secreting macrophage phenotype in all three species, with numerous genes enriched responsible for pathogen detection, downstream signal transduction, and production of pro-inflammatory cytokines and chemokines. However, while IFNγ restricted intracellular Mtb growth in murine and bovine macrophages, it showed limited efficacy in human macrophages. Transcriptome analysis uncovered significant differences in IFNγ-mediated gene regulation among the species. Notably, ~77.7% of differentially expressed orthologous genes were species-specific upon IFNγ-stimulation and Mtb infection. Among these, numerous genes associated with the JAK-STAT signaling pathway. In particular, the transcription of NOS2 showed the most notable difference, with murine and bovine macrophages upregulating its transcription, while human macrophages did not. Different transcription of NOS2 was confirmed at the protein level and in functional assays, indicating conserved differential activation of NOS2, which was also confirmed additionally in freshly isolated monocytes and ex vivo activated alveolar macrophages across studied species. In conclusion, our data suggest that IFNγ responses induce unique molecular processes despite a universal transcriptional immune response in macrophages and monocytes from the murine, human, or bovine host. These findings not only enhance our understanding of protective immunity against Mtb but also have implications for vaccine design. The necessity to investigate protective immune responses against Mtb in diverse natural hosts and experimental models is underscored, emphasizing the importance of considering species-specific responses in developing effective TB interventions.
• Mycobacterium tuberculosis (Mtb) stellt eine erhebliche globale Gesundheitsbedrohung dar, was die Identifikation protektiver Immunantworten in verschiedenen Wirtspezies erforderlich macht, um Ausrottungsbemühungen durch neuartige Impfstrategien zu unterstützen. Während bekannt ist, dass die Sekretion des Zytokins Interferon-Gamma (IFNγ) durch T-Zellen eine primäre antimikrobakterielle Reaktion bei Säugetieren mit unterschiedlicher Anfälligkeit gegenüber Mtb darstellt, ist das Wissen über die nachgeschalteten Effekte von IFNγ auf Makrophagen natürlicher Wirte sowie über artspezifische Unterschiede unvollständig. In dieser Studie verglichen wir systematisch die IFNγ-vermittelte Schutzwirkung primärer Makrophagen von Mensch, Rind und Maus gegen Mtb. Mithilfe von Mtb-Wachstumsassays, hochauflösender Mikroskopie, funktionellen Tests, RNA-Sequenzierung und qPCR untersuchten wir Gemeinsamkeiten und Unterschiede in den protektiven Immunantworten. Unsere Ergebnisse zeigen, dass unter vergleichbaren Kulturbedingungen IFNγ in allen drei Spezies einen proinflammatorischen, CXCL10-sezernierenden Makrophagen-Phänotyp induzierte. Dabei wurden zahlreiche Gene angereichert, die für die Pathogenerkennung, nachgeschaltete Signaltransduktion sowie für die Produktion proinflammatorischer Zytokine und Chemokine verantwortlich sind. Allerdings hemmte IFNγ das intrazelluläre Wachstum von Mtb in murinen und bovinen Makrophagen, zeigte jedoch nur eine begrenzte Wirksamkeit in humanen Makrophagen. Die Transkriptomanalyse offenbarte signifikante Unterschiede in der IFNγ-vermittelten Genregulation zwischen den Spezies. Bemerkenswerterweise waren etwa 77,7 % der differentiell exprimierten orthologen Gene artspezifisch nach IFNγ-Stimulation und Mtb-Infektion. Unter diesen befanden sich zahlreiche Gene, die mit dem JAK-STAT-Signalweg assoziiert sind. Besonders auffällig war die Transkription von NOS2: Während murine und bovine Makrophagen NOS2 hochregulierten, zeigten humane Makrophagen keine derartige Induktion. Diese unterschiedliche Transkription von NOS2 konnte auf Proteinebene und in funktionellen Tests bestätigt werden, was auf eine konservierte differenzielle Aktivierung von NOS2 hinweist. Diese wurde zudem in frisch isolierten Monozyten und ex vivo aktivierten alveolären Makrophagen der untersuchten Spezies verifiziert. Zusammenfassend deuten unsere Daten darauf hin, dass IFNγ-Antworten trotz einer universellen transkriptionellen Immunreaktion in Makrophagen und Monozyten muriner, humaner und boviner Herkunft artspezifische molekulare Prozesse induzieren. Diese Erkenntnisse erweitern nicht nur unser Verständnis protektiver Immunität gegen Mtb, sondern haben auch weitreichende Implikationen für die Impfstoffentwicklung. Unsere Ergebnisse unterstreichen die Notwendigkeit, protektive Immunantworten gegen Mtb in verschiedenen natürlichen Wirten und experimentellen Modellen zu untersuchen und dabei artspezifische Reaktionen bei der Entwicklung wirksamer TB-Interventionen zu berücksichtigen.