Björn Brinschwitz

• Skeletal muscle is a dynamic tissue with high plasticity which maintains its functionality by regulating the balance between protein degradation and protein synthesis. In response to injury and other pathological conditions like inflammation and sepsis, a loss in muscle mass (muscle atrophy) and function (metabolic homeostasis, contractility) occurs. Critically ill septic patients often develop intensive care unit-acquired weakness (ICUAW), characterized by muscle weakness and atrophy as well as insulin resistance. Sepsis and inflammation are major risk factors for ICUAW. However, the pathogenesis of this syndrome is poorly understood but a disturbed glucose homeostasis and an enhanced inflammation are implicated. Previous RNA sequencing and quantitative real-time polymerase chain reaction (qRT-PCR) analyses of RNAs isolated from human M. vastus lateralis of critically ill patients and muscles from septic mice revealed an increased expression of the protein tyrosine phosphatases protein tyrosine phosphatase 1 B (PTP1B/PTPN1) and t-cell protein tyrosine phosphatase (TCPTP/PTPN2). In parallel a decreased expression of insulin receptor substrate (IRS) 1 and reduced insulin receptor (INSR) phosphorylation indicative for insulin resistance was observed. Because PTP1B and TCPTP are nodal enzymes in insulin and cytokine signaling in skeletal muscle and immune cells these data suggested their involvement in inflammation-mediated insulin resistance and skeletal muscle atrophy. I hypothesized that PTP1B and TCPTP are major regulators of insulin signaling and inflammation via dephosphorylation of cytokine receptor associated proteins in skeletal muscle. To investigate the mechanism responsible for Ptpn1 and Ptpn2 upregulation during inflammation I treated C2C12 myocytes with the inflammatory cytokine interleukin 6 (IL-6). IL-6 increased the expression of Ptpn1 and Ptpn2. Using small interfering RNA (siRNA) and chemical inhibitors, I found that this effect was mediated by the transmembrane IL-6 receptor glycoprotein 130 (Gp130) and the downstream kinases Janus kinase 2 (JAK2) and Signal transducer and activator of transcription 3 (STAT3). IL-6 facilitates its pro- and anti-inflammatory effects through the transcription factor STAT3, which gets tyrosine phosphorylated, translocates into the nucleus and modulates the expression of IL-6 responsive genes, such as suppressor of cytokine signaling 3 (Socs3). Overexpression of PTP1B and TCPTP attenuated IL-6 mediated STAT3 tyrosine phosphorylation and Socs3 gene expression. Overexpression of PTP1B but not TCPTP inhibited insulin mediated phosphorylation of the insulin receptor beta chain and its downstream targets IRS1, Akt (protein kinase B), and Akt substrate of 160 kDa (AS160) in C2C12 myocytes. To investigate the role of PTP1B and TCPTP in skeletal muscle in vivo, I generated male and female mice devoid of Ptpn1 (Ptpn1 cKO), Ptpn2 (Ptpn2 cKO) and Ptpn1+Ptpn2 (DKO) in myocytes. I subjected these mice to polymicrobial sepsis for 24 hours or 96 hours employing cecal ligation and puncture surgery (CLP). Sham treated male and female KO and wildtype (WT) mice served as controls. Septic DKO mice showed a higher mortality compared to their sham operated littermates and septic WT mice. Morphological and histological analyses showed a higher muscle mass loss and more muscle atrophy, tissue leucocyte infiltration and leucocyte marker gene expression in muscle of septic DKO mice. This was accompanied by an increased pro-inflammatory cytokine signature with increased amounts of interleukin 1 beta (IL-1β/Il1b), tumor necrosis factor alpha (TNFα/Tnfa), interferon gamma (IFNγ/Ifng) and IL-6/Il6 in skeletal muscle and serum of septic DKO mice. Chemokines that are chemo attractants for immune cells, like C-C-motif ligand 2 and 5 (Ccl2, Ccl5) and C-X-C motif ligands 9 and 10 (Cxcl9, Cxcl10) were upregulated on gene expression level in muscle tissue as well as in serum of septic DKO mice compared to septic WT mice. Additionally, I observed an increased NLR family pyrin domain containing 3 (NLRP3) -inflammasome activation in muscle of septic DKO mice. Inflammasomes are multiprotein complexes which facilitate innate immune responses after infection by activation of caspases which cleave and mediate the release pro-inflammatory cytokines like IL-1β and interleukin 18 (IL-18). In addition, using global proteomics analyses I observed a significantly dysregulated interferon γ (IFNγ) response in TA muscle of septic DKO mice shown by increased IFN stimulated gene (ISG) expression, increased abundancy of interferon regulatory factor 1 (IRF1) transcription factor as well as increased IFN-dependent chemokine expression. Utilizing murine myocytes in vitro and treating them with IFNγ, I reproduced the phenotype seen in mice. These data are indicative for a myocyte specific phenotype. I could also activate the NLRP3 inflammasome in primary myocytes from mice that were differentiated into myotubes. In these cells I show that the release of IL-1β and GSDMD is dependent on PTP1B and TCPTP; further validating the results seen in TA muscle of septic mice. In summary, deficiency of PTP1B and TCPTP caused a hyperinflammatory systemic and skeletal muscle phenotype which was caused by a dysregulated IFNγ and NLRP3 inflammasome response to infection. Furthermore, it pronounces the role of skeletal muscle as a highly immunomodulatory organ, which is crucial in maintaining whole body proteo- and homeostasis. Therefore, inhibition of PTPs should be carefully evaluated in a clinical setting.
• Der Skelettmuskel ist ein dynamisches Gewebe mit hoher Plastizität, dass seine Funktionalität durch die Regulierung des Gleichgewichts zwischen Proteinabbau und Proteinsynthese aufrechterhält. Infolge von Verletzungen und anderen pathologischen Zuständen wie Entzündungen und Sepsis kommt es zu einem Verlust an Muskelmasse (Muskelatrophie) und Funktion (metabolische Homöostase, Kontraktilität). Kritisch kranke septische Patienten entwickeln häufig eine intensivmedizinisch erworbene Muskelschwäche (ICUAW), die durch Muskelschwäche, Atrophie sowie Insulinresistenz gekennzeichnet ist. Sepsis und Entzündungen sind bedeutende Risikofaktoren für ICUAW. Die Pathogenese dieses Syndroms ist jedoch nur unzureichend verstanden, wobei eine gestörte Glukosehomöostase und verstärkte Entzündungen eine Rolle spielen. RNA-Sequenzierungen und quantitative Echtzeit-PCR-Analysen (qRT-PCR) von RNAs, die aus dem humanen M. vastus lateralis kritisch kranker Patienten und den Muskeln septischer Mäuse isoliert wurden, zeigten eine erhöhte Expression der Protein-Tyrosin-Phosphatasen Protein-Tyrosin-Phosphatase 1B (PTP1B/PTPN1) und T-Zell-Protein-Tyrosin-Phosphatase (TCPTP/PTPN2). Parallel dazu wurde eine verringerte Expression des Insulinrezeptorsubstrats (IRS) 1 und eine reduzierte Insulinrezeptorphosphorylierung beobachtet, was auf eine Insulinresistenz hindeutet. Da PTP1B und TCPTP zentrale Enzyme in der Insulin- und Zytokin-Signalübertragung in Skelettmuskel- und Immunzellen sind, deuten diese Daten auf ihre Beteiligung an der durch Entzündung vermittelten Insulinresistenz und Muskelatrophie hin. Ich stellte die Hypothese auf, dass PTP1B und TCPTP wichtige Regulatoren der Insulin Signaltransduktion und Inflammation durch die Dephosphorylierung von zytokinrezeptorassoziierten Proteinen im Skelettmuskel sind. Um den Mechanismus zu untersuchen, der für die Hochregulierung von Ptpn1 und Ptpn2 während einer Entzündung verantwortlich ist, behandelte ich C2C12-Myoblasten mit dem pro-inflammatorischen Zytokin Interleukin 6 (IL-6). IL-6 erhöhte die Expression von Ptpn1 und Ptpn2. Mithilfe von small interfering RNA (siRNA) und chemischen Inhibitoren stellte ich fest, dass dieser Effekt durch den transmembranen IL-6-Rezeptor Glycoprotein 130 (Gp130) und die nachgelagerten Kinasen Janus-Kinase 2 (JAK2) und Signal Transducer and Activator of Transcription 3 (STAT3) vermittelt wurde. IL-6 vermittelt seine pro- und anti-inflammatorischen Effekte über den Transkriptionsfaktor STAT3, der tyrosin-phosphoryliert wird, in den Zellkern transloziert und die Expression von IL-6-abhängigen Genen wie Suppressor of Cytokine Signaling 3 (Socs3) moduliert. Die Überexpression von PTP1B und TCPTP reduzierte die IL-6-vermittelte STAT3-Tyrosinphosphorylierung und die Socs3-Genexpression. Die Überexpression von PTP1B, jedoch nicht von TCPTP, hemmte die Insulin-vermittelte Phosphorylierung der Insulinrezeptor-Beta-Kette und ihrer nachgelagerten Zielmoleküle IRS1, Akt (Proteinkinase B) und Akt-Substrat von 160 kDa (AS160) in C2C12-Myoblasten. Um die Rolle von PTP1B und TCPTP im Skelettmuskel in vivo zu untersuchen, generierte ich männliche und weibliche Mäuse, die kein Ptpn1 (Ptpn1 cKO), Ptpn2 (Ptpn2 cKO) oder sowohl Ptpn1 als auch Ptpn2 (DKO) in Myozyten exprimierten. Diese Mäuse unterzog ich einer polymikrobiellen Sepsis für 48 Stunden durch Zäkalligation und Punktion (CLP). Scheinoperierte männliche und weibliche KO- und Wildtyp (WT)-Mäuse dienten als Kontrollgruppen. Septische DKO-Mäuse zeigten eine höhere Mortalität im Vergleich zu ihren scheinoperierten Wurfgeschwistern und septischen WT-Mäusen. Morphologische und histologische Analysen zeigten einen größeren Verlust an Muskelmasse, mehr Muskelatrophie, Gewebeinfiltration durch Leukozyten sowie eine erhöhte Expression von Leukozyten-Marker Genen in den Muskeln septischer DKO-Mäuse. Dies wurde von einer verstärkten pro-inflammatorischen Zytokinsignatur begleitet, mit erhöhten Mengen an Interleukin 1 Beta (IL-1β/Il1b), Tumornekrosefaktor Alpha (TNFα/Tnfa), Interferon Gamma (Ifnγ) und IL-6/Il6 im Skelettmuskel und Serum der septischen DKO-Mäuse. Chemokine, die als Chemoattraktoren für Immunzellen wirken, wie C-C-Motiv-Ligand 2 und 5 (Ccl2, Ccl5) und C-X-C-Motiv-Liganden 9 und 10 (Cxcl9, Cxcl10), waren auf Genexpressionsebene in Muskelgeweben sowie im Serum septischer DKO-Mäuse hochreguliert. Zudem beobachtete ich eine verstärkte Aktivierung des NLR-Familien-Pyrindomänen-enthaltenden 3 (NLRP3) -Inflammasoms in den Muskeln septischer DKO-Mäuse. Inflammasome sind Multiproteinkomplexe, die nach Infektionen angeborene Immunreaktionen durch die Aktivierung von Caspasen erleichtern, welche die Freisetzung pro-inflammatorischer Zytokine wie IL-1β und Interleukin 18 (IL-18) vermitteln. Durch globale Proteomik-Analysen stellte ich außerdem eine signifikant dysregulierte Interferon-Gamma-(IFNγ)-Antwort in den TA-Muskeln septischer DKO-Mäuse fest, gekennzeichnet durch eine erhöhte Expression von IFN-stimulierten Genen (ISG), eine erhöhte Menge des Transkriptionsfaktors Interferon-Regulator-Faktor 1 (IRF1) sowie eine verstärkte IFN-abhängige Chemokinexpression. Durch Experimente an murinen Myozyten in vitro und deren Behandlung mit IFNγ reproduzierte ich den bei den Mäusen beobachteten Phänotyp. Diese Daten deuten auf einen myozytenspezifischen Phänotyp hin. Ich konnte ebenfalls das NLRP3-Inflammasom in primären, zu Myotuben differenzierten, Myozyten aktivieren. In diesen Zellen zeigte ich, dass die Freisetzung von IL-1β und GSDMD von PTP1B und TCPTP abhängt, was die Ergebnisse aus den TA-Muskeln septischer Mäuse weiter bestätigte. Zusammenfassend führte ein Mangel an PTP1B und TCPTP zu einem hyperinflammatorischen systemischen und skelettmuskulären Phänotyp, der durch eine dysregulierte IFNγ- und NLRP3-Inflammasom-Antwort auf Infektionen verursacht wurde. Daher sollte die Hemmung von PTPs in einem klinischen Kontext sorgfältig evaluiert werden. Darüber hinaus unterstreichen diese Ergebnisse die Rolle des Skelettmuskels als ein hoch immunmodulatorisches Organ, das für die Aufrechterhaltung der gesamten Proteo- und Homöostase entscheidend ist.