Ning Li

• Muscle-specific RING finger (MuRF) proteins are muscle-restricted E3 ubiquitin ligases that regulate protein degradation in striated muscle. MuRF proteins perform coordinated functions to maintain striated muscle structure and function that are dependent on their target proteins. MuRF1 plays a pivotal role in muscle atrophy. MuRF2 and MuRF3 have been shown to bind to and stabilize microtubules, affecting striated muscle differentiation and contraction. While a number of MuRF interaction partners have been identified, only a limited number have been demonstrated to undergo proteasomal degradation. To gain a deeper insight into the function of MuRF proteins, the aim was to identify and functionally characterize novel MuRF target proteins and to elucidate the regulatory functions of these MuRF-mediated proteins in myocytes. To identify the interactome of MuRF proteins, stable isotope labeling of amino acids in cell culture (SILAC) was employed, followed by affinity purification and quantitative mass spectrometry analysis (AP-MS). Using this approach our group identified the mammalian retromer subunit sorting nexin 5 (SNX5) as a novel MuRF2 and MuRF3 interaction partner. SNX5 is involved in vesicle trafficking and coats early endosomes (EEs). However, it was not known whether SNX5 was targeted by MuRF2 or MuRF3 for proteasomal degradation. It was also unclear whether SNX5 abundance is associated with regulation of cargo content in EEs and whether this affects myocyte homeostasis and differentiation. In my doctoral thesis I tested the hypothesis that MuRF2 and MuRF3 physically interact with SNX5. I also hypothesized that SNX5 regulates the endosomal uptake of proteins that are important for myogenic differentiation. To test these hypotheses, I performed coimmunoprecipitation experiments and immunocytochemistry, and confirmed that MuRF2 and MuRF3 physically interact and colocalize with SNX5, respectively. I found that MuRF2 mediated the ubiquitin-proteasome system (UPS)-dependent degradation of SNX5, which was dependent on its RING finger domain. In contrast, MuRF3 did not mediate SNX5 ubiquitination for proteasomal degradation. Using mass spectrometry, I identified the regulatory subunit of protein kinase A (RI-α) as a cargo of SNX5-coated EEs in myocytes. Loss-of-function experiments using CRISPR-Cas9 and siRNA revealed that SNX5 regulates PKA activity by stabilizing RI-α in myocytes. SNX5 deletion resulted in PKA activation and inhibition of the HDAC5-MEF2 axis. This led to increased expression of myostatin, which attenuated myogenic differentiation. Taken together, MuRF2 and MuRF3 exert opposing effects on SNX5-mediated retrograde transport of EEs along microtubules in myocytes. This mechanism plays a role in regulating PKA catalytic activity via stabilization of RI-α, which in turn regulates myogenic differentiation via control of myostatin expression.
• Muscle-specific RING finger (MuRF) Proteine sind muskel-spezifische E3-Ubiquitin-Ligasen, die den Proteinabbau in quergestreiften Muskeln regulieren. MuRF-Proteine übernehmen koordinierte Aufgaben für die Aufrechterhaltung der Struktur und Funktion der quergestreiften Muskulatur, die von ihren Zielproteinen abhängen. MuRF1 spielt eine zentrale Rolle im Prozess der Muskelatrophie. MuRF2 und MuRF3 binden und stabilisieren nachweislich Mikrotubuli, was die Differenzierung und Kontraktion der quergestreiften Muskeln beeinflusst. Es wurden zwar einige MuRF-Interaktionspartner identifiziert, aber nur für eine begrenzte Anzahl von ihnen wurde nachgewiesen, dass sie proteasomal abgebaut werden. Um einen tieferen Einblick in die Funktion der MuRF-Proteine zu gewinnen, war es das Ziel, neue MuRF-Zielproteine zu identifizieren und funktionell zu charakterisieren sowie die regulatorischen Funktionen dieser MuRF-vermittelten Proteine in Myozyten zu klären. Zur Identifizierung des Interaktoms von MuRF-Proteinen wurde die stabile Isotopenmarkierung von Aminosäuren in der Zellkultur (SILAC) eingesetzt, gefolgt von Affinitätsreinigung und quantitativer Massenspektrometrie (AP-MS). Zunächst identifizierte unser Labor die Säugetier-Retromer-Untereinheit Sorting Nexin 5 (SNX5), die am subzellulären Transport beteiligt ist, als neuen Interaktionspartner von MuRF2 und MuRF3. Anschließend wurden Co-Immunpräzipitationsexperimente und Immunzytochemie durchgeführt, um die physische Interaktion und Co-Lokalisierung zwischen SNX5 und MuRF2 oder MuRF3 zu bestätigen. Insbesondere wurde beobachtet, dass MuRF2 den UPS (Ubiquitin-Proteasom-System) abhängigen Abbau von SNX5 in einer Weise vermittelt, die von der RING-Finger-Domäne abhängig ist, während MuRF3 diesen Prozess abschwächt. Mittels Massenspektrometrie konnte die regulatorische Untereinheit der Proteinkinase A (RI-α) als Fracht von SNX5-beschichteten frühen Endosomen in Myozyten identifiziert werden. CRISPR-Cas9- und siRNA-Experimente zeigten, dass SNX5 die PKA-Aktivität durch Stabilisierung von RI-α in Myozyten reguliert. Es wurde beobachtet, dass die Deletion von SNX5 zur Aktivierung von PKA und zur Hemmung der HDAC5-MEF2-Achse führt, was nachweislich die myogene Differenzierung durch die Erhöhung von Myostatin stört. Zusammengenommen üben MuRF2 und MuRF3 gegensätzliche Wirkungen auf den SNX5-vermittelten retrograden Transport von frühen Endosomen entlang der Mikrotubuli in Myozyten aus. Daher spielt dieser Mechanismus eine Rolle bei der Regulierung der katalytischen Aktivität von PKA über die Stabilisierung von RI-α und übt eine Kontrolle während der Differenzierung der quergestreiften Muskeln aus.