Erik Kalinka

• Coccolithophores are an abundant group of unicellular haptophyte algae that inhabit all oceans and play a crucial role in marine ecosystems and global biogeochemical cycles. They surround themselves with shells composed of intricately shaped mineralized scales called coccoliths. Coccoliths are produced intracellularly. Their formation requires an insoluble organic scale termed the base plate, which templates the nucleation of calcite crystals along its rim. These initial crystals then grow into complex, species-specific morphologies that cannot be replicated by current materials chemistry techniques. Efforts to study coccolithophore calcification have been stymied by the lack of genetic tools with which to test hypotheses about the underlying molecular mechanisms. Although protocols for the genetic modification of coccolithophores have been reported, they are limited to the stable expression of antibiotic resistance markers and the transient expression of fluorescent proteins in the cytosol. In this work, I developed a new antibiotic selection system and a suite of transgene expression tools for the model coccolithophore Chrysotila carterae. I engineered plasmids containing viral and endogenous promoters, artificial introns, and a 2A self-cleaving peptide, and tested these genetic elements for their ability to confer stable expression of fluorescent proteins in the alga. Following their transformation, several constructs yielded fluorescent lines. I then employed the most effective sequences to stably express fluorescent protein fusions, generating marker lines for the endoplasmic reticulum, chloroplasts, and microtubule cytoskeleton. To elucidate the molecular details of coccolithophore biomineralization, I conducted a proteomic analysis of isolated base plates from C. carterae cells, which led to the identification of 59 proteins potentially involved in coccolith formation. By expressing YFP fusions and using fluorescence microscopy, I then investigated the distribution of six of these candidates in live cells and purified coccoliths. One fusion protein became incorporated into the rims of both coccolith base plates and organic body scales in vivo. It remained attached when the coccoliths were isolated and their calcite crystals were dissolved. These findings mark the identification and functional in vivo characterization of the first genuine coccolithophore scale protein and its encoding gene. The expanded molecular genetic toolbox of C. carterae described here paves the way for answering fundamental questions of coccolithophore biology, including how they control mineral precipitation and morphogenesis.
• Die Coccolithophoride sind eine häufig vorkommende Gruppe einzelliger Haptophyten-Algen, die in allen Ozeanen leben und eine entscheidende Rolle in marinen Ökosystemen und globalen biogeochemischen Kreisläufen spielen. Sie umgeben sich mit Schalen, die aus kunstvoll geformten, mineralisierten Schuppen bestehen, den sogenannten Coccolithen. Coccolithe werden intrazellulär gebildet. Ihre Entstehung erfordert eine unlösliche organische Schuppe, die als Basalplatte bezeichnet wird und als Matrix für die Keimbildung von Calcitkristallen entlang ihres Randes dient. Diese initialen Kristalle wachsen anschließend zu komplexen, artspezifischen Morphologien heran, die mit den derzeitigen Methoden der Materialchemie nicht nachgebildet werden können. Die Erforschung der Kalzifizierung bei Coccolithophoriden wurde bisher durch das Fehlen genetischer Werkzeuge erschwert, mit denen sich Hypothesen über die zugrunde liegenden molekularen Mechanismen überprüfen ließen. Obwohl bereits Protokolle zur genetischen Modifikation von Coccolithophoriden beschrieben wurden, beschränken sie sich auf die stabile Expression von Antibiotikaresistenzmarkern und die transiente Expression fluoreszierender Proteine im Cytosol. In dieser Arbeit habe ich ein neues System zur Antibiotikaselektion sowie eine Reihe von molekularen Werkzeugen zur Transgenexpression für den Modell-Coccolithophorid Chrysotila carterae entwickelt. Ich konstruierte Plasmide mit viralen und endogenen Promotoren, künstlichen Introns und einem selbstspaltenden 2A-Peptid und testete diese genetischen Elemente hinsichtlich ihrer Fähigkeit, eine stabile Expression fluoreszierender Proteine in der Alge hervorzurufen. Nach der Transformation führten mehrere Konstrukte zur Bildung fluoreszierender Linien. Anschließend nutzte ich die effektivsten Sequenzen zur stabilen Expression von Fusionsproteinen mit Fluoreszenzmarkern und erzeugte Linien zur Markierung des endoplasmatischen Retikulums, der Chloroplasten und des Mikrotubuli-Zytoskeletts. Zur Aufklärung der molekularen Details der Biomineralisation bei Coccolithophoriden führte ich eine proteomische Analyse isolierter Basalplatten aus Zellen von C. carterae durch, wodurch 59 Proteine identifiziert wurden, die möglicherweise an der Coccolithenbildung beteiligt sind. Durch die Expression von YFP-Fusionsproteinen und den Einsatz fluoreszenzmikroskopischer Methoden untersuchte ich anschließend die Verteilung von sechs dieser Kandidaten in lebenden Zellen und isolierten Coccolithen. Ein Fusionsprotein wurde in vivo sowohl in die Ränder der Coccolith-Basalplatten als auch in die Ränder organischer Körperschuppen eingebaut. Das Protein blieb auch nach der Isolierung der Coccolithen und der Auflösung ihrer Calcitkristalle gebunden. Diese Ergebnisse stellen die Identifikation und funktionelle in-vivo-Charakterisierung des ersten echten Coccolithophoriden-Schuppenproteins und seines codierenden Gens dar. Das hier beschriebene erweiterte molekulargenetische Werkzeugset für C. carterae ebnet den Weg zur Beantwortung grundlegender Fragen der Coccolithophoriden-Biologie, insbesondere wie sie die Mineralfällung und -morphogenese kontrollieren.