Hannes Meinert

• Unsustainable industrial growth over the past centuries lead to a waste problem of global concern. Recognized by the United Nations as a major hazard to the long-term survival of the human species, sustainable development goals were conceived to halt this crisis. To achieve these goals, the chemical industry holds major potential. In this context, the research field of "Green Chemistry" has been coined, aiming to reduce wastes, develop energy efficient synthesis protocols, and ensure sustainable production of chemical commodities. An important aspect of "Green Chemistry" constitutes the development of biocatalytic reaction protocols. Highly required by the chemical industry is the transformation of amines into carbamates. They are present as structural motifs in pharmaceuticals, agrochemicals, and polymeric materials. Due to the outstanding stability and diversity of carbamate bonds they are most relevant as amine protecting groups. Traditionally, the protection of amines employs hazardous reagents and harsh reaction conditions, resulting in inefficient chemical routes. Evidently, replacement of these ancient methods with modern, sustainable approaches is highly demanded. In this regard, the present thesis is focused on illustrating the scope of enzyme-catalyzed carbamate bond synthesis. In the first chapter, the potential of public databases for the discovery of novel enzymes, useful for the synthesis of carbamates, was explored. While, this ever-growing sequence space provides a rich source of novel biocatalysts, it is considered impossible to biochemically characterize all of them. Consequently, bioinformatic approaches were investigated to rationalize the selection of promising candidates. Chapter two follows up by expanding the capability of the promiscuous esterase/acyltransferase PestE to catalyze carbamate synthesis. Its substrate scope was greatly expanded, achieving up to 99 % isolated carbamate. Most notably, introducing the allyloxycarbonyl (Alloc)- and benzyloxycarbonyl (Cbz)-protecting group was facilitated. In the final chapter, protein engineering approaches were employed to further expand the capabilities of promiscuous esterases/acyltransferases. This provided variants of PestE that catalyzed the synthesis of sterically demanding carbamates with up to 110-fold improved conversions over the wild-type.
• Das industrielle Wachstum der letzten Jahrhunderte, in einem nicht nachhaltigen Ausmaß, hat ein globales Abfallproblem herbeigeführt. Die Vereinten Nationen erkannten, dass dies eine große Gefahr für das langfristige Überleben der menschlichen Spezies darstellt, und haben Ziele für eine nachhaltige Entwicklung formuliert, um diese Krise zu stoppen. Die chemische Industrie hat großes Potenzial um zu der Erreichung dieser Ziele beizutragen. In diesem Zusammenhang wurde der Forschungsbereich „Grüne Chemie“ ins Leben gerufen, der darauf abzielt, Abfälle zu reduzieren, energieeffiziente Syntheseprotokolle zu entwickeln und eine nachhaltige Produktion von chemischen Rohstoffen zu gewährleisten. Einen wichtigen Aspekt der „Grünen Chemie“ stellt die Entwicklung biokatalytischer Reaktionsprotokolle dar. In der chemischen Industrie ist die Umwandlung von Aminen in Carbamate sehr gefragt. Sie sind als strukturelle Motive in Pharmazeutika, Agrochemikalien und polymeren Materialien zu finden. Aufgrund der herausragenden Stabilität und Vielfalt von Carbamatbindungen, ist ihre Verwendung als Schutzgruppe für Amine am wichtigsten. Traditionell werden zur Schützung von Aminen gefährliche Reagenzien und harsche Reaktionsbedingungen verwendet, was ineffiziente chemische Prozesse ergibt. Es liegt auf der Hand, dass diese alten Methoden durch moderne, nachhaltige Ansätze ersetzt werden müssen. In Hinblick darauf, konzentriert sich die vorliegende Arbeit darauf, das Potenzial der enzymkatalysierten Carbamatbindungssynthese darzustellen. Im ersten Kapitel wurde das Potenzial öffentlicher Datenbanken für die Entdeckung neuartiger Enzyme, die für die Synthese von Carbamaten nützlich sind, untersucht. Obwohl diese stätig wachsende Menge an Proteinsequenzen eine reichhaltige Quelle neuartiger Biokatalysatoren darstellt, wird es als unmöglich angesehen alle von ihnen biochemisch zu charakterisieren. Daher wurden bioinformatische Ansätze untersucht um die Auswahl vielversprechender Kandidaten zu rationalisieren. In Kapitel zwei wurde die Fähigkeit der promiskuitiven Esterase/Acyltransferase PestE zur Katalyse der Carbamatsynthese weiter ausgebaut. Das Spektrum zugägnlicher Substrate wurde stark erweitert, so dass isolierte Ausbeuten bis zu 99 % erreicht werden konnten. Der größte Erfolg dieser Ergebnisse besteht darin, dass die Einführung der Allyloxycarbonyl-(Alloc) und Benzyloxycarbonyl-(Cbz) Schutzgruppen erreicht wurde. Im letzten Kapitel wurden Methoden des "Protein-Engineering" eingesetzt, um die Fähigkeiten von promiskuitiven Esterasen/Acyltransferasen zu erweitern. So konnten Varianten von PestE erstellt werden, die die Synthese sterisch anspruchsvoller Carbamate mit bis zu 110-fach verbesserten Umsätzen, gegenüber dem Wildtyp, katalysierten.