Christopher Saade

• Proteases are vital enzymes involved in signaling, homeostasis, and protein turnover. In host-pathogen interactions, bacterial proteases can benefit the pathogen while harming the host. Staphylococcus aureus (S. aureus) secretes several virulence-associated proteases, including six serine-protease like proteins Spl (SplA–SplF) encoded by the spl operon. Uniquely, these proteases promote Th2-skewed responses rather than the typical Th1/Th17 immunity seen with other S. aureus antigens. This prompted our investigation into their role as modulators of host immunity. In this work, we focused on SplA and SplB. In collaboration with other members of the research training group RTG-PRO research group, we successfully established an optimized expression system that yielded highly pure recombinant Spl proteins with preserved post-translational modifications. This enabled the identification of several previously unrecognized Spl substrates, including three intermediate filament proteins (desmin, vimentin, and nestin), heat shock protein beta-1, alpha-enolase 1, and immunoglobulin G. Functional assays revealed that SplA and SplB have a low pro-inflammatory potential, evidenced by weak IL-6 induction in human peripheral blood mononuclear cells and monocytes, but they could prime the inflammasome in murine bone marrow-derived macrophages. Despite this low stimulatory activity, consistent humoral responses were found across diverse human populations, with the induction of specific IgG1, IgG4, and IgE antibodies. Notably, SplB was able to activate human basophils through IgE-mediated mechanisms under appropriate conditions, while serum containing other antibody classes inhibited this activation. To investigate the clinical relevance of our findings, we collaborated with TongRen Hospital to explore the potential role of Spl proteases in a chronic rhinosinusitis (CRS) patient cohort based in Beijing. Nasal swab isolates of S. aureus from both healthy individuals and CRS patients were compared. We observed that the presence of the spl operon was strongly associated with specific S. aureus clonal lineages such as CC5, CC7, and CC8. Notably, splA and splB were the most frequently detected spl genes, present in 59.5% of isolates, while 40.5% of isolates lacked the entire spl operon. We further evaluated serum antibody responses and found that both healthy individuals and CRS patients exhibited anti-Spl IgG1, IgG4, and IgE antibodies. However, CRS patients tended to have higher titers of IgG4 and IgE compared to healthy individuals. Cytokine profiling of nasal polyp tissues obtained during surgical resection revealed that colonization with S. aureus strains harboring the spl operon was associated with a more pronounced Th2 cytokine profile. Overall, we identified several biologically relevant substrates of SplA and SplB, highlighting the protease’s versatility in targeting both extracellular and intracellular host proteins. These targets suggest that SplB may contribute to the dissemination of S. aureus, particularly through the cleavage of intermediate filament proteins, which are critical for maintaining the structural integrity of various cell types. In addition, SplB-mediated cleavage of key substrates involved in immune function, including alpha-enolase 1, heat shock protein beta-1, and Immunoglobulin G suggests a role for this protease in immune modulation and evasion. Moreover, this thesis underscores the immunomodulatory potential of Spl proteases as contributors to Th2 immune polarization during S. aureus colonization or infection and supports the notion of a mechanistic link between Spl proteases and allergic eosinophilic inflammation in chronic rhinosinusitis (CRS).
• Proteasen sind essenzielle Enzyme, die an Signalübertragung, Homöostase und Proteinabbau beteiligt sind. In der Wirt-Pathogen-Interaktion können bakterielle Proteasen dem Erreger zugutekommen und gleichzeitig den Wirt schädigen. Staphylococcus aureus (S. aureus) sezerniert mehrere virulenzassoziierte Proteasen, darunter sechs serinproteaseähnliche Proteine Spl (SplA–SplF), die vom spl-Operon kodiert werden. Anders als typische S. aureus-Antigene induzieren diese Proteasen bevorzugt Th2-gerichtete Immunantworten statt der sonst üblichen Th1/Th17-Reaktionen. Dies veranlasste uns, ihre Rolle als Modulatoren der Wirtsimmunität näher zu untersuchen. In dieser Arbeit konzentrierten wir uns auf SplA und SplB. In Zusammenarbeit mit weiteren Mitgliedern der RTG-PRO Forschungsgruppe etablierten wir ein optimiertes Expressionssystem, das hochreine rekombinante Spl-Proteine mit erhaltenen posttranslationalen Modifikationen lieferte. Dies ermöglichte die Identifizierung mehrerer zuvor nicht erkannter Spl-Substrate, darunter drei Intermediärfilamentproteine (Desmin, Vimentin und Nestin), Hitzeschockprotein Beta-1, Alpha-Enolase 1 und Immunglobulin G. Funktionelle Analysen zeigten, dass SplA und SplB ein geringes proinflammatorisches Potenzial besitzen, was durch eine schwache IL-6-Induktion in menschlichen peripheren mononukleären Zellen und Monozyten belegt wird. Dennoch konnten sie den Inflammasom-Priming-Prozess in murinen Knochenmark-abgeleiteten Makrophagen initiieren. Trotz dieser geringen stimulierenden Aktivität wurden konsistente humorale Antworten in verschiedenen humanen Populationen nachgewiesen, einschließlich der Induktion spezifischer IgG1-, IgG4- und IgE-Antikörper. Bemerkenswerterweise war SplB in der Lage, humane Basophile über IgE-vermittelte Mechanismen unter geeigneten Bedingungen zu aktivieren, während Serum, das andere Antikörperklassen enthielt, diese Aktivierung hemmte. Zur Untersuchung der klinischen Relevanz unserer Befunde kooperierten wir mit dem TongRen Hospital, um die potenzielle Rolle der Spl-Proteasen in einer Patientenpopulation mit chronischer Rhinosinusitis (CRS) in Peking zu analysieren. Nasenabstrich-Isolate von S. aureus sowohl gesunder Probanden als auch CRS-Patienten wurden verglichen. Wir beobachteten, dass das Vorhandensein des spl-Operons stark mit bestimmten S. aureus-Klonlinien wie CC5, CC7 und CC8 assoziiert war. Auffällig war, dass splA und splB mit 59,5 % am häufigsten detektiert wurden, während 40,5 % der Isolate das gesamte spl-Operon nicht aufwiesen. Wir untersuchten weiterhin die Serumantikörperantworten und stellten fest, dass sowohl gesunde Personen als auch CRS-Patienten anti-Spl-IgG1-, IgG4- und IgE-Antikörper aufwiesen. CRS-Patienten neigten jedoch zu höheren IgG4- und IgE-Titern im Vergleich zu gesunden Individuen. Zytokinanalysen aus während der Operation entnommenen Nasenpolypgeweben zeigten, dass die Kolonisation durch S. aureus-Stämme mit spl-Operon mit einem ausgeprägteren Th2-Zytokinprofil assoziiert war. Insgesamt identifizierten wir mehrere biologisch relevante Substrate von SplA und SplB, was die Vielseitigkeit dieser Proteasen in der Spaltung sowohl extrazellulärer als auch intrazellulärer Wirtproteine unterstreicht. Diese Zielstrukturen deuten darauf hin, dass SplB zur Dissemination von S. aureus beitragen könnte, insbesondere durch die Spaltung von Intermediärfilamentproteinen, die entscheidend für die strukturelle Integrität diverser Zelltypen sind. Zudem legt die SplB-vermittelte Spaltung wichtiger Substrate der Immunfunktion, darunter Alpha-Enolase 1, Hitzeschockprotein Beta-1 und Immunglobulin G, eine Rolle dieser Protease in der Immunmodulation und Immunflucht nahe. Darüber hinaus hebt diese Arbeit das immunmodulatorische Potenzial der Spl-Proteasen als Faktoren der Th2-Immunpolarisierung während der Kolonisation oder Infektion durch S. aureus hervor und unterstützt die Annahme eines mechanistischen Zusammenhangs zwischen Spl-Proteasen und allergischer eosinophiler Entzündung bei chronischer Rhinosinusitis (CRS).