Open Access

Susanne Brigitte Brück

• Die Wirksamkeit und Sicherheit einer Arzneitherapie wird durch zahlreiche pharmakokinetische Prozesse beeinflusst. Neben den durch CYP-450-Enzym vermittelten Biotransformationsvorgängen sind zunehmend Transportprozesse durch Arzneimitteltransporter aus der ABC- sowie SLC-Familie in den Fokus getreten, welche unter anderem in den Membranen der Enterozyten, aber auch in weiteren Organen exprimiert sind. Die Expression und Funktion der Arzneimitteltransporter kann beispielsweise durch Arzneistoffe beeinflusst werden und somit in Arzneimittelwechselwirkungen resultieren. Dass diese Regulationsmechanismen eine hohe Komplexität aufweisen, ist aus einer Vielzahl von klinischen Interaktionsstudien ersichtlich. In diesen führte die Applikation von bekannten Induktoren des Arzneistoffmetabolismus und -transports zu organspezifischen Veränderungen in der Pharmakokinetik der gleichzeitig verabreichten Arzneistoffe. Ziel dieser Arbeit war es, zu einem besseren Verständnis der Expression und Regulation intestinaler Arzneimitteltransporter beizutragen, um somit Auswirkungen auf die Pharmakokinetik besser vorhersagen zu können. Dies beinhaltete zum einen die Mitarbeit an der Entwicklung und Validierung einer LC-MS/MS-basierten Methode zur Proteinquantifizierung, mit welcher auch in limitierten Gewebemengen die am stärksten exprimierten Membrantransporter ABCB1 (P-gp), ABCC2 (MRP2), ABCG2 (BCRP) und SLC15A1 (PEPT1) quantifiziert werden konnten. Parallel dazu wurden die Prozesse zur mRNA-Isolierung und -Quantifizierung optimiert. In der präklinischen Forschung wird weitverbreitet das Caco-2-Zellmodell zur Prädiktion der intestinalen Absorption genutzt. Im Rahmen dieser Arbeit sollte das Caco-2-Zellmodell dahingehend untersucht werden, ob es ein geeignetes Modell zur Prädiktion der intestinalen Absorption darstellt, auch in Bezug auf Induktionsvorgänge. In bereits publizierten Arbeiten wurde häufig eine gute Korrelation des Transporterexpressionsmusters auf mRNA-Ebene zwischen Caco-2 und Jejunum gezeigt. Die vorliegenden vergleichenden Ergebnisse zur mRNA- und Proteinexpression von Arzneimitteltransportern zeigten, dass sowohl im Zellmodell als auch im jejunalen Gewebe in Teilen deutliche Diskrepanzen zwischen mRNA und Transporterexpression bestehen. Auf der für die Funktion der Arzneimitteltransporter relevanten Proteinebene zeigten sich für ABCB1, ABCC2 und ABCG2 relativ gute Übereinstimmungen, während die Proteinexpression anderer Transporter, insbesondere OATP2B1, im Zellmodell deutlich abwich. Dies verdeutlicht, dass insgesamt Vorsicht geboten ist in der Prädiktion der intestinalen Absorption mittels Caco-2-Zellmodell, da zudem bereits auf mRNA-Ebene gezeigt worden ist, dass die Expression der Transporter sowohl von dem Zellklon als auch von den Kulturbedingungen anhängig ist. Darüber hinaus wurde in dieser Arbeit gezeigt, dass die Expression der Transporter in dem Zellmodell sowohl auf mRNA- als auch auf Proteinebene zeitlich variabel ist. Somit empfiehlt sich ein noch vorsichtiger Umgang mit Daten zur intestinalen Absorption, welche auf Basis eines Caco-2-Modells mit verkürzter Kultivierungszeit erhoben worden sind. Induktionsprozesse konnten weder auf Ebene der mRNA-Expression oder des Proteingehaltes noch auf Ebene der Funktion in dem Caco-2-Zellmodell durch Inkubation mit prototypischen Induktoren des Arzneistoffwechsels (Carbamazepin, Efavirenz, Johanniskrautextrakt, Rifampicin) simuliert werden. Weiterhin wurde die Induktion von intestinalen Arzneimitteltransportern in vivo untersucht. Chronische Gabe von Rifampicin führte zu einem Anstieg von ABCB1 und ABCC2 auf mRNA Ebene, welches nur im Fall von ABCB1 (P-gp) auf Proteinebene umgesetzt wurde. Die chronische Applikation von Carbamazepin resultierte ausschließlich in einer Induktion auf mRNA Ebene. Im Vergleich zu Rifampicin war diese jedoch auch geringer ausgeprägt. Der PXR-Ligand Rifampicin kann aufgrund einer hohen intestinalen PXR-Expression eine stärkere Induktion hervorrufen als Carbamazepin, welches präferentiell den nukleären Rezeptor CAR aktiviert. Begünstigt wird dies darüber hinaus dadurch, dass Rifampicin, nicht aber Carbamazepin, einem enterohepatischen Kreislauf unterliegt und Rifampicin somit über einen längeren Zeitraum im Intestinum in einer Konzentration vorliegt, welche notwendig ist, um eine Aktivierung der nukleären Rezeptoren zu erreichen. Regulationsvorgänge durch miRNAs können dafür verantwortlich sein, dass eine erhöhte Expression der mRNA nicht parallel mit einem Anstieg des Proteingehaltes einhergeht. Durch Korrelationsanalysen, in silico-Prädiktion sowie Untersuchungen mittels Reportergen-Assays konnten in der vorliegenden in vivo-Studie drei Interaktionen zwischen miRNAs und mRNAs (ABCB1 - miR-485-3p; ABCC2 - miR-26a-5p; ABCG2 - miR-577) identifiziert werden, welche potentiell den Translationsprozess verhindert bzw. abgeschwächt haben. Korrelationsanalysen mit bereits zuvor erhobenen Daten zur Pharmakokinetik der applizierten probe drugs deuten darauf hin, dass die systemische Verfügbarkeit von Ezetimib und dessen Glukuronid durch intestinales ABCB1 (P-gp), nicht jedoch wie zuvor angenommen durch intestinales ABCC2 (MRP2) beeinflusst wird. Insgesamt konnten nach chronischer Gabe von Rifampicin Korrelationen entlang der Signalkaskade ausgehend von der mRNA-Expression von PXR, über die mRNA Expression von ABCB1, unter Berücksichtigung der Expression der miRNA 485-3p bis hin zum Gehalt und der Funktion von ABCB1 (P-gp) gezeigt werden. Veränderungen des Plasmaspiegels von Talinolol nach chronischer Gabe von Carbamazepin sind hingegen nicht auf Induktionsvorgänge intestinaler Transportprozesse zurückzuführen. Die Ursachen dafür sind u.a. in der Erhöhung der renalen Clearance zu suchen. Zusammengefasst konnte gezeigt werden, dass nukleäre Rezeptoren, miRNAs und die pharmakokinetischen Eigenschaften der Induktoren selbst maßgeblich an der differenziellen Regulation von Transportprozessen beteiligt sind.
• The efficacy and safety of pharmacotherapy is influenced by numerous pharmacokinetic processes. In addition to biotransformation processes mediated by CYP 450 enzymes, transport processes have become increasingly important. In these transport processes, drug transporters from the ABC and SLC families, which are located in the membranes of the enterocytes as well as in other organs, are involved. The expression and function of these drug transporters can be influenced for example by concomitantly administered drugs and thus, potentially result in drug-drug interactions. Several clinical drug-drug interaction studies have shown that underlying regulatory mechanisms are highly complex. In these studies, known inducers of drug metabolism and transport led to organ-specific alterations in pharmacokinetics of simultaneously administered drugs. The aim of this work was to contribute to a better understanding of expression and regulation of intestinal drug transporters and thereby to better predict alterations in pharmacokinetics. This included the contribution to the development and validation of a LC-MS/MS-based method for protein quantification. Using this method, the most strongly abundant membrane transporters ABCB1 (P-gp), ABCC2 (MRP2), ABCG2 (BCRP) and SLC15A1 (PEPT1) could be quantified even in very limited tissue samples. In parallel, the processes for mRNA isolation and quantification have been optimized. The Caco-2 cell model is widely used for the prediction of intestinal absorption in preclinical research. In this work, it should be assessed whether the Caco-2 cell model is a suitable model for the prediction of intestinal absorption, also in terms of induction processes. In several already published studies, a good correlation of the transporter expression pattern in Caco-2 cells and in human jejunum at mRNA level has been shown. Results at hand, comparing transporter expression at mRNA and at protein level indicate that huge discrepancies between mRNA expression and protein abundance exist in both cell model and jejunal tissue. In terms of protein abundance, which is relevant for transporter function, ABCB1, ABCC2, and ABCG2 showed relatively good similarities, whereas protein abundance of other transporters, in particular OATP2B1, deviated significantly in the cell model. This indicates that caution is advised in the prediction of intestinal absorption using Caco-2 cells, since it has already been shown before that expression of transporters at mRNA level depends also on cell clone and on culture conditions. Furthermore, this work has shown that the expression of drug transporters in the Caco-2 cell model varies along with culture-time at both the mRNA and protein level. This has to be taken into account using absorption data derived from accelerated cultivation protocols. Induction processes could neither be simulated at mRNA or protein level nor at level of function in the Caco-2 cell model after incubation with prototypical inducers of drug metabolism (carbamazepine, efavirenz, St. John's wort extract, rifampin). Furthermore, induction of intestinal drug transporters has been investigated in vivo. Chronic administration of rifampin caused an increase in mRNA expression of ABCB1 and ABCC2, which was only translated into enhanced protein amount in the case of ABCB1 (P-gp). Chronic administration of carbamazepine resulted exclusively in induction at mRNA, but not at protein level. However, compared to rifampin, the increase was less pronounced. Due to a high intestinal PXR expression, the PXR ligand rifampin can cause a markedly stronger induction in intestine than carbamazepine, which preferentially binds to CAR. In addition, rifampin undergoes an enterohepatic circulation and therefore it is available in the intestine at concentrations required for activation of nuclear receptors over a longer period of time. In addition to nuclear receptors, miRNAs may contribute to the regulation of intestinal transporters. In detail, miRNAs may be responsible for the fact that an increased mRNA expression is not translated into increased protein abundance. Correlation analysis, in silico prediction and reporter gene assays identified three interactions between miRNAs and mRNAs (ABCB1 - miR-485-3p; ABCC2 - miR-26a-5p; ABCG2 - miR-577) that potentially inhibit or attenuate protein translation. Moreover, correlation analysis with previous pharmacokinetic data of probe drugs indicated that systemic bioavailability of ezetimibe and its glucuronide is predominantly affected by intestinal ABCB1 (P-gp), but not by intestinal ABCC2 (MRP2) as previously assumed. Overall, after chronic administration of rifampin correlations along the overall signaling cascade could be demonstrated, starting from PXR mRNA expression, via ABCB1 mRNA expression, taking into consideration expression of miRNA 485-3p up to the protein abundance and function of ABCB1 (P-gp). However, altered plasma levels of talinolol after chronic administration of carbamazepine are not caused by induction of intestinal transport processes, but e.g. by an increase in renal clearance. In summary, in present work it could be demonstrated that various factors including nuclear receptors, miRNAS and the pharmacokinetic properties of the inducers themselves contribute to differential regulation of transport processes.