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Analyse der metabolischen Anpassung von Streptococcus pneumoniae an antimikrobielle Umwelteinflüsse
(2019)
Das Gram-positive Bakterium Streptococcus pneumoniae ist ein humanspezifisches Pathogen des oberen Respirationstraktes. Der opportunistische Krankheitserreger kann jedoch mehrere Organe befallen und tiefer in den Körper vordringen, was zu lokalen Entzündungen wie Sinusitis und Otitis media oder zu lebensbedrohlichen Infektionen wie Pneumonie, Meningitis oder Sepsis führen kann. Für das Bakterium S. pneumoniae wurden bisher kaum Metabolom-Daten erhoben. Daher war das Ziel dieser Dissertation eine umfassende Charakterisierung des Metaboloms von S. pneumoniae. In dieser Dissertation wurden als analytische Methoden die Gaschromatografie (GC) und Flüssigkeitschromatografie (LC) jeweils gekoppelt mit Massenspektrometrie (MS) sowie die Kernspinresonanzspektroskopie (NMR) verwendet, um die Metaboliten zu analysieren. Es sind mehrere Analysetechniken erforderlich, um den Großteil des Metaboloms mit seinen chemisch verschiedenen Metaboliten zu erfassen. Artikel I fasst die Literatur zu Untersuchungen des Metabolismus von S. pneumoniae in den letzten Jahren zusammen. Um eine Momentaufnahme des biologischen Systems zum jeweiligen Zeitpunkt zu erhalten, ist neben dem reproduzierbaren Wachstum während der Kultivierung auch die exakte Probenahme zu beachten. Aus diesem Grund wurde in dieser Dissertation ein Probenahmeprotokoll für das Endometabolom von S. pneumoniae etabliert (Artikel II). Mithilfe des optimierten Protokolls wurde eine umfassende Metabolomanalyse in einem chemisch definierten Medium durchgeführt (Artikel II). Um S. pneumoniae in einer Umgebung ähnlich der im Wirt zu untersuchen, wurde in einem modifizierten Zellkulturmedium kultiviert. Intermediate zentraler Stoffwechselwege von S. pneumoniae wurden analysiert. Das intrazelluläre Stoffwechselprofil wies auf einen hohen glykolytischen Flux hin und bot Einblicke in den Peptidoglykan-Stoffwechsel. Darüber hinaus widerspiegelten die Ergebnisse die biochemische Abhängigkeit von S. pneumoniae von aus dem Wirt stammenden Nährstoffen. Ein umfassendes Verständnis der Stoffwechselwege von Pathogenen ist wichtig, um Erkenntnisse über die Anpassungsstrategien während einer Infektion zu gewinnen und so neue Angriffspunkte für Wirkstoffe zu identifizieren.
Die zunehmende Verbreitung von resistenten S. pneumoniae-Stämmen zwingt zur Suche nach neuen antibiotisch wirksamen Substanzen. Im Zuge dessen wurde in Artikel III die metabolische Reaktion von S. pneumoniae während des Wachstums unter dem Einfluss antibakterieller Substanzen mit dem Ziel der Identifizierung metabolischer Anpassungsprozesse untersucht. Dabei wurden Antibiotika mit unterschiedlichen Wirkmechanismen verwendet, wie die Beeinflussung der Zellwandbiosynthese (Cefotaxim, Teixobactin-Arg10), der Proteinbiosynthese (Azithromycin) sowie Nukleotidsynthese (Moxifloxacin). Es konnten keine Wirkmechanismus-spezifischen Marker-Metaboliten identifiziert werden. Jedes Antibiotikum verursachte weitreichende Veränderungen im gesamten Metabolom von S. pneumoniae. Die Nukleotid- und Zellwandsynthese waren am stärksten betroffen. Besonders vielversprechend sind Antibiotika mit zwei Wirkorten wie Teixobactin-Arg10 und Kombinationen aus zwei Antibiotika. In dieser Dissertation wurde das erste Mal das synthetisch hergestellte Teixobactin-Arg10 mittels einer der modernen OMICS-Techniken untersucht. Die vorliegende umfassende Metabolom-Studie bietet wertvolle Erkenntnisse für Forscher, die an der Identifizierung neuer antibakterieller Substanzen arbeiten.
Insgesamt tragen die Ergebnisse der Dissertation zu einem besseren Verständnis der bakteriellen Physiologie bei.
Als Mitglieder der Ordnung Lactobacillales ist das Hauptkatabolit der Pneumokokken sowohl unter aerober wie auch microaerophiler Atmosphäre Lactat. Des Weiteren synthetisiert S. pneumoniae eine große Bandbreite an ABC-Transportersystemen, die an der Assimilation und an dem Stoffwechsel von Kohlenhydraten, löslichen Verbindungen und Aminosäuren beteiligt sind. In dieser Arbeit wurde der Kohlenstoffmetabolismus mittels 13C-Isotopologen Verteilung nach Wachstum der Pneumokokkenkultur in chemisch definiertem Medium (CDM) mit [U-13C6]Glucose, [1,2-13C2]Glucose oder [U-13C2]Glycin analysiert. GC/MS-Analysen zeigten ein Muster an schwer-markierten und unmarkierten Kohlenstoffatomen in den Aminosäuren. Die Ergebnisse ließen den Schluss zu, dass Pneumokokken sowohl einzelne Aminosäuren aufnehmen, wie auch über klassische oder nicht-klassische Biosynthesewege de novo synthetisieren können. His, Glu, Ile, Leu, Val, Pro und Gly blieben im Isotopolog Profiling unmarkiert, was ein Hinweis auf das Fehlen von Biosynthesewegen oder ihrer Regulation unter bestimmten Umweltbedingungen sein könnte. Obwohl die genetische Information für die Biosynthese der essentiellen verzweigtkettigen Aminosäuren (BAA; Ile, Leu und Val) in S. pneumoniae vorhanden ist, ergaben die 13C-Markierungsversuche keine de novo Synthese. Jedoch konnte durch Langzeit-1H-NMR (LT-NMR) Analysen eine aktive Aufnahme dieser Aminosäuren nachgewiesen werden. Darüber hinaus wird Aspartat nicht über den allgemeinen Stoffwechselweg mit Pyruvat und Acetyl-CoA synthetisiert. Die Aspartat-Synthese erfolgt im ersten Schritt durch die Umwandlung von Phosphoenolpyruvat (PEP) und CO2 zu Oxalacetat. Im zweiten Schritt wird Oxalacetat dann in Aspartat mit der Nebenreaktion Glutamat zu alpha-Ketoglutarat durch die Aspartat-Transaminase metabolisiert. GC/MS Analysen ergaben weiterhin, dass komplett markierte aromatische Aminosäuren aus Erythrose-4-Phosphat und zwei Molekülen PEP über das Intermediat Chorismat synthetisiert wurden. Es zeigte sich außerdem, dass [M+1] markiertes Serin durch die Hydroxymethylierung von unmarkiertem Glycin über 5,10-Methylentetrahydrofolat als Teil des C1-Pools hergestellt wurde. Weiterhin wurden In LT-NMR-Untersuchungen Konzentrationsänderungen der extrazellulären Metabolite quantifizert. Die homofermentative Milchsäuregärung konnte in Pneumokokken durch einen extrazellulären Anstieg der Lactatkonzentration nachgewiesen werden. Als essentielle Kandidaten wurden Glutamin und Uracil identifiziert, die das Pneumokokkenwachstum bei Mangel einschränken. Diese Ergebnisse zeigen die Vielzahl von Aminosäuren-Synthesewegen in Pneumkokken und die notwendige Rolle der Transportersysteme in Pneumokokken für die bakterielle Fitness und für die Adaption an verschiedene Wirtsnischen. Sechs mögliche Glutamin-Aufnahmesysteme konnten durch Genomanalysen von Streptococcus pneumoniae Stämmen identifiziert werden. Die Reverse Transkriptions-PCR haben gezeigt, dass die sechs gln-Operons unter in vitro Bedingungen exprimiert werden. Vier der gln-Gencluster bestehen aus den Genen glnQPH, während in zwei Regionen das Gen glnH, welches für eine lösliche Glutamin-Bindungsdomäne kodiert, fehlt. In dieser Arbeit wurde der Einfluss zwei dieser Glutamin-ABC-Transporter, mit den Operons glnQPH0411/0412 und glnQPH1098/1099, in S. pneumoniae D39 auf Virulenz und Phagozytose untersucht. Die zwei charakterisierten Transportersysteme bestehen jeweils aus der ATPase GlnQ und einem translatorischem Fusionsprotein aus der Permease GlnP und dem Bindungsprotein GlnH. Für die Untersuchungen wurden diese beiden Transporter mittels Insertations-Deletions-Mutagenese inaktiviert. CD-1 Mäuse, die intranasal mit biolumineszierenden D39delgln0411/0412 infiziert wurden, zeigten in Echtzeit eine signifikant erhöhte Überlebenszeit und eine Attenuierung bei der Ausprägung einer Pneumonie im Vergleich zu biolumineszierenden Wildtyp D39 Pneumokokken. Im murinen Sepsismodell mit der D39delgln0411/0412-Mutante zeigte sich eine gemäßigte, aber signifikante Abschwächung der Pathogenese. Im Gegensatz dazu war die D39delgln1098/1099 Mutante sowohl im murinen Pneumonie- wie auch Sepsismodell massiv attenuiert. Es war eine 100- bis 10000- fach höhere Infektionsdosis erforderlich, um mit der D39delgln1098/1099-Mutante eine vergleichbare Pathogenese der Pneumonie oder Sepsis wie beim Wildtypstamm D39 hervorzurufen. Im experimentellen Meningitismodell zeigten sich bei der D39delgln1098/1099-Mutante eine erniedrigte Anzahl an Leukozyten im Liquor und ein reduzierter Bakterientiter im Blut im Vergleich zu D39 und D39delgln0411/0412. Auch die Phagozytose-Experimente bestätigten eine signifikante verminderte Überlebensrate der beiden gln-Mutanten im Vergleich zum Wildtyp S. pneumoniae D39, was auf den Einfluss der bakteriellen Fitness auf den Schutz gegen oxidativen Stress hinweist. Diese Ergebnisse demonstrierten, dass beide Glutamin-Aufnahmesysteme für die vollständige Virulenz der Pneumokokken essentiell sind, aber verschiedene Auswirkungen auf die Pathogenese der Bakterien unter in vivo Bedingungen haben. Das Zelloberflächenprotein PavA der Pneumokokken ist ein Virulenzfaktor, der für invasive Erkrankungen wichtig ist. In dieser Arbeit wurde gezeigt, dass PavA essentiell für die in vivo Besiedlung von Streptococcus pneumoniae D39 in den oberen Atemwegen von Mäusen ist. In dem murinen Pneumoniemodell wurden pavA-Mutanten nicht aus den infizierten Mauslungen eliminiert, sondern persistierten und lösten somit eine chronische Infektion aus, während Wildtyp-Pneumokokken systemische Erkrankungen verursachten. PavA-defiziente Pneumokokken konnten unter experimentellen Bedingungen nicht aus der Lunge in die Blutbahn streuen. Diese Ergebnisse ließen den Schluss zu, dass PavA an der erfolgreichen Kolonisation der Schleimhautoberflächen und an der Translokation der Pneumokokken durch Wirtsbarrieren beteiligt ist.
Streptococcus pneumoniae (Pneumokokken) sind Gram-positive und Katalase-negative humanspezifische Kommensalen der oberen und unteren Atemwege. Diese Bakterien sind andererseits auch als schwere Krankheitserreger bekannt und verursachen bei verschiedenen Bevölkerungsgruppen, wie beispielsweise Kindern, Älteren und immungeschwächten Personen sowohl Atemwegs- als auch lebensbedrohliche invasive Erkrankungen wie eine ambulant erworbene Pneumonie, Meningitis und Sepsis. Pneumokokken haben aufgrund ihrer Besiedelung des Respirationstraktes effiziente Mechanismen entwickelt, um in einer sauerstoffreichen Nische überleben zu können. Dabei richten sich die Mechanismen vor allem gegen reaktive Sauerstoffspezies (Reactive Oxygen Spezies, ROS), die einerseits als Abwehrfunktion des Wirts (oxidative burst) vom angeborenen Immunsystem und andererseits von den Pneumokokken selbst produziert werden, um als chemische Waffe zur Bekämpfung bakterieller Konkurrenten in ihrem Habitat eingesetzt zu werden. In der vorliegenden Arbeit wurde ein hochkonserviertes Zwei-Operon-System, das für die extrazelluläre oxidative Stress-Resistenz in S. pneumoniae verantwortlich ist, identifiziert und auf pathophysiologischer sowie struktureller Ebene charakterisiert. Dieses komplexe System besteht aus zwei integralen Cytochrom C-ähnlichen Membranproteinen (CcdA1 und CcdA2), zwei Thioredoxin-ähnlichen Lipoproteinen (Etrx1 und Etrx2) und einer Methioninsulfoxid-Reduktase AB2 (MsrAB2). Die Etrx-Proteine werden zwar in zwei räumlich voneinander getrennten Operonen kodiert, sind aber funktionell miteinander verbunden. Der Einfluss des Systems auf die Pathogenese der Pneumokokken wurde in Maus-Virulenz-Studien und Untersuchungen der Phagozytose unter Verwendung von isogenen Mutanten gezeigt. Sowohl in den in vivo als auch den in vitro Experimenten konnte gezeigt werden, dass der Verlust der Funktion beider Etrx-Proteine beziehungsweise der Methioninsulfoxid-Reduktase MsrAB2 die Virulenz der Pneumokokken stark reduziert. Hieraus resultierte eine erheblich verringerte Letalität des Wirts, eine beschleunigte bakterielle Aufnahme durch die Makrophagen sowie ein schnelleres Abtöten der Pneumokokken durch eine oxidative Schädigung von Oberflächen-lokalisierten Proteinen mittels Wasserstoffperoxid. Die Ergebnisse deuten darauf hin, dass Etrx2 die Abwesenheit von Etrx1 und umgekehrt Etrx1 das Defizit von Etrx2 kompensieren kann. Durch Strukturaufklärung der beiden Thioredoxin-ähnlichen Proteine Etrx1 und Etrx2 sowie der Modellierung der beteiligten Komponenten CcdA und MsrAB2 konnte die Rolle jedes einzelnen Proteins dieses Systems (CcdA-Etrx-MsrAB2-System) bei der Reparatur beschädigter Oberflächen-lokalisierter Proteine in einem Modell dargestellt werden. Das postulierte Modell konnte über in vivo und in vitro Untersuchungen des Elektronentransfers innerhalb dieses Systems bestätigt werden. Mit der Bestimmung der Standardredoxpotentiale der rekombinanten Proteine Etrx1, Etrx2 und der Einzeldomänen MsrA2 und MsrB2 konnte in vitro gezeigt werden, dass der Elektronenfluss in Richtung von Etrx1 und Etrx2 zu MsrAB2 erfolgen muss. Die direkte Elektronenübertragung zwischen diesen Proteinen konnte in kinetischen Experimenten gezeigt werden. Die Messungen ergaben, dass Etrx1 bevorzugt mit der MsrA2-Untereinheit interagiert beziehungsweise Etrx2 sowohl mit der MsrA2-Untereinheit als auch mit der MsrB2-Untereinheit in Wechselwirkung treten kann. Der in vivo Redoxzustand von MsrAB2 wurde unter Verwendung der nicht-reduzierenden/reduzierenden „2D-Diagonal“-SDS-PAGE in den isogenen ccdA- und etrx-Mutanten bestimmt. Hierbei konnte ein Unterschied im Redoxzustand von MsrAB2 in den isogenen Einzelmutanten und Doppelmutanten von ccdA und etrx beobachtet werden. Während in den Einzelmutanten der Elektronenfluss innerhalb des CcdA-Etrx-MsrAB2-Systems unverändert war, zeigte sich in den Doppelmutanten ccdA1/ccdA2 und etrx1/etrx2 eine deutliche Beeinträchtigung der Elektronenübertragung auf MsrAB2, welche sich in der Zunahme der oxidierten Form von MsrAB2 deutlich machte. Somit konnte der Elektronenfluss von sowohl von CcdA1 über Etrx1 zu MsrAB2 als auch von CcdA2 über Etrx2 zu MsrAB2 in vivo betätigt werden. In Anbetracht der Ergebnisse dieser Arbeit könnte das hochkonservierte CcdA-Etrx-MsrAB2-System der extrazellulären oxidativen Stress-Resistenz von S. pneumoniae zur Entwicklung proteinbasierter Pneumokokken-Impfstoffe und zum Angriffspunkt für Behandlungen gegen diese wichtigen humanpathogenen Erreger beitragen.
Pneumokokken haben verschiedene Virulenzfaktoren, die nicht nur den Kolonisierungsprozess unterstützen, sondern auch das Vordringen des Pathogens in tiefere Gewebsschichten ermöglichen oder einen Schutz vor den Komponenten des Immunsystems vermitteln. Diese Virulenzfaktoren stehen im Mittelpunkt der Untersuchungen für die aktuelle Impfstoffentwicklung. Die genomische Analyse verschiedener Streptococcus pneumoniae Stämme identifizierte den Pneumococcal adherence and virulence factor B (PavB) als LPXTG-verankertes Oberflächenprotein. PavB enthält repetitive SSURE-Sequenzen (Streptococcal Surface Repeats), die mit humanem Fibronektin interagieren. Das Molekulargewicht des hochkonservierten Proteins wird von der Anzahl der SSURE-Domänen bestimmt und variiert zwischen den unterschiedlichen Pneumokokkenstämmen. In dieser Arbeit konnte gezeigt werden, dass PavB ein Adhäsin auf der Oberfläche von Pneumokokken darstellt und am Kolonisierungsprozess der Pneumokokken unter in vivo Bedingungen beteiligt ist. Mäuse, die intranasal mit pavB-Deletions-Mutanten infiziert wurden, überlebten signifikant länger als die mit den Wildtypbakterien infizierten Tiere. Der PavB-defiziente Stamm zeigte im Vergleich zum parentalen Wildtyp eine verringerte Kolonisierung des Nasopharynx sowie eine verzögerte Ausbreitung in die Lunge. Dies konnte in Echtzeit unter Verwendung von biolumineszierenden Pneumokokken gezeigt werden. In Koinfektionsexperimenten mit gleichen Infektionsdosen von Wildtyp-Pneumokokken und isogenen pavB-Mutanten war die Mutante in ihrer Fähigkeit, sich in den Organen der oberen und unteren Atemwege auszubreiten, eingeschränkt. Im Gegensatz dazu war die Pathogenese einer Meningitis nach intrazerebraler Injektion der Pneumokokken, sowie die Erkennung und Phagozytose durch phagozytierende Zellen des angeborenen Immunsystems, unabhängig von der Produktion des PavB Proteins. Die Immunogenität des Oberflächenproteins unter relevanten Bedingungen wurde durch den Nachweis von PavB-spezifischen Antikörpern in Patientenseren gezeigt. Auf eine Rolle des Oberflächenproteins PavB während der bakteriellen Adhäsion an eukaryotische Zellen deuteten die Infektionsexperimente mit humanen Epithelzelllinien. Es wurden verschiede His6-getaggte PavB-Derivate (SSURE2, SSURE2+3, SSURE1-5) für die weitere funktionelle Charakterisierung von PavB gereinigt und in Bindungsstudien eingesetzt. Die Funktion von PavB als Adhäsin konnte in Kompetitionsexperimenten unter Verwendung eines PavB-Derivats als Inhibitor bestätigt werden. Ebenso konnte die direkte Bindung des Proteins an eukaryotische Zellen nachgewiesen werden, wobei der eukaryotische Rezeptor noch nicht identifiziert wurde. In Protein-Protein-Interaktionsstudien wurden zusätzlich zu Fibronektin weitere humane Proteine des Plasmas und der extrazellulären Matrix (EZM), die im Laufe einer Infektion mit Pneumokokken einen Vorteil für das bakterielle Überleben im Wirt vermitteln könnten, als Bindungspartner für die drei gereinigten SSURE-Proteine identifiziert. Als neues Fibronektin-Bindungsprotein (FnBP) von S. pneumoniae diente PavB desweiteren für die Bestimmung der Bindungsregion von FnBPs von Pneumokokken im Fibronektinmolekül. Die Verwendung rekombinanter Fibronektinfragmente (His6-FnIII-Fragmente) ermöglichte den Nachweis der Beteiligung der Typ III-Domänen des C-terminalen Bereichs von Plasmafibronektin an der Interaktion zwischen PavB-Derivaten und Fibronektin. Die Bedeutung von Plasmafibronektin (pFn) für die Pathogenese einer Pneumonie wurde in einem induzierbaren knockout-Mausmodell für Plasmafibronektin untersucht. Nach intranasaler Infektion der Mäuse mit S. pneumoniae hatte der Verlust des Plasmaproteins unter den verwendeten Bedingungen keine signifikante Auswirkung auf die Entstehung einer Lungenentzündung oder die Überlebensaussicht der pFn-knockout-Mäuse. Unter in vitro Bedingungen bewirkte die Bindung von pFn an phagozytierende Zellen eine erhöhte Bindung der Pneumokokken an die Phagozyten. Dagegen beeinflusste die Rekrutierung von pFn an die Pneumokokkenoberfläche nicht die Phagozytose. Bisher konnte nicht eindeutig geklärt werden, welche Funktion Fibronektin während der Infektion mit Pneumokokken ausübt. Neben seinen multifunktionellen Bindungseigenschaften stellt das hochkonservierte Protein PavB einen interessanten Bestandteil für ein neues, Protein-basiertes Pneumokokkenvakzin dar.
Posttranslationale Proteinmodifikationen beeinflussen Proteinaktivitäten und Signalwege innerhalb einer Zelle und haben somit vielfältige Auswirkungen auf den Stoffwechsel von Bakterien. Um die genauen Mechanismen besser verstehen zu können, wurde in dieser Arbeit das Phosphoproteom von Streptococcus pneumoniae D39 untersucht. Der Schwerpunkt lag dabei in der Entwicklung besserer Auswertestrategien und der damit einhergehenden verbesserten Identifizierung von Phosphoproteinen. Um dies zu bewerkstelligen, wurden die Proteinextrakte durch gelfreie und gelbasierte Methoden aufgetrennt. Die Auswertung der Experimente erfolgte zunächst durch klassische Proteinidentifizierung mit Hilfe von Proteindatenbanken. Zusätzlich wurden Spektrenbibliotheken von S. pneumoniae D39 aufgebaut und diese für eine bessere Proteinidentifizierung sowie Phosphoproteinidentifizierung genutzt. Anschließend wurden zur Quantifizierung des Phosphoproteoms dieses Pathogens verschiedene Quantifizierungsmethoden getestet und modifiziert. Hierbei wurde zum einen das Phosphoproteom einer Kinasedeletionsmutante von S. pneumoniae D39 über die Spotintensitäten von 2D Gelen mit dem Wildtyp verglichen. Zusätzlich wurden die Auswirkungen dieser Kinase auf das globale S. pneumoniae D39 Proteom mittels SILAC sowie der neu erstellten Spektrenbibliothek aufgezeigt. Eine weitere etablierte Quantifizierungsmethode für Phosphoproteine in der Arbeit war die Kombination von metabolischer Markierung und 2D Gelen. Die Veränderung des Phosphoproteoms wurde an dem industriell bedeutsamen Bakterium Bacillus pumilus anhand von oxidativem Stress aufgezeigt.