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Den Ausgangspunkt für die vorliegende Arbeit bilden Versuche, in denen bei spontan hypertensiven Ratten durch neonatale Sympathektomie eine Senkung des arteriellen Mitteldrucks hervorgerufen wurde. Durch Nierentransplantation und bilaterale Nephrektomie konnte diese Blutdrucksenkung auf bis dahin unbehandelte Empfängertiere übertragen werden. Der renale Gefäßwiderstand der sympathektomierten SHR war dabei im Vergleich zu scheinbehandelten Kontrolltieren reduziert. Das Ziel der von uns durchgeführten Studie war es deshalb, mögliche Veränderungen in der Funktionsweise arterieller, renaler Widerstandsgefäße zu charakterisieren, die bei spontan hypertensiven Ratten an der Blutdrucksenkung durch neonatale Sympathektomie beteiligt sein können. Mit der Methode der Small-Vessel-Drahtmyographie wurde dazu das Konstriktions- und Dilatationsverhalten isolierter Segmente der distalen Interlobararterien ex vivo untersucht. Diese Gefäße entsprechen mit einem Durchmesser von etwa 150 µm den proximalen renalen Widerstandsarterien der spontan hypertensiven Ratten. Das Untersuchungsmaterial ist männlichen SHR im Alter von 12 Wochen entnommen worden. Die Tiere waren bis dahin einem von drei Vorbehandlungsschemata zugeordnet. Sie wurden entweder neonatal sympathektomiert, scheinsympathektomiert und mit Hydralazin antihypertensiv behandelt oder ausschließlich scheinsympathektomiert. Die entnommenen, isolierten Segmente der renalen Widerstandsgefäße wurden zunächst hinsichtlich ihrer Antwort auf die Depolarisation des Membranpotentials untersucht. Diese bestand in allen Vorbehandlungsgruppen aus einer Vasokonstriktion ähnlichen Ausmaßes. Kumulative Konzentrations-Wirkungs-Kurven für die physiologischen Vasokonstriktoren Noradrenalin, Vasopressin und Endothelin-1 ergaben keine verminderte Reaktivität der distalen Interlobararterien nach Sympathektomie. Die Gefäßsegmente der sympathektomierten SHR verhielten sich supersensitiv gegenüber Noradrenalin und konstringierten nach Endothelin 1-Gabe stärker als die entsprechenden Gefäße der scheinbehandelten Tiere. Die Empfindlichkeit der Noradrenalin-induzierten Vasokonstriktion gegenüber extrazellulärem Kalzium war in der sympathektomierten Gruppe und bei den Kontrolltieren gleich groß. Auf die Aktivierung der L Typ-Kalziumkanäle mit S( ) BayK8644 reagierten die untersuchten Arterienabschnitte nach Sympathektomie und nach Hydralazin-Behandlung sensitiver als nach alleiniger Scheinbehandlung. Die endothelvermittelte, mit Acetylcholin ausgelöste Vasodilatation und die endothelunabhängige Relaxation der distalen Interlobararterien mit Nitroprussidnatrium zeigten bei den Tieren aller Vorbehandlungsgruppen ähnliche Ausmaße. Versuche mit L NAME und Indomethacin stehen im Einklang mit Befunden, die auf die Existenz eines endothelialen, Zyklooxygenase-abhängigen Konstriktionsfaktors und auf das Vorhandensein eines endothelialen, Zyklooxygenase- und Stickstoffmonoxidsynthase-unabhängigen relaxatierend wirkenden Faktors hindeuten. Die Wirkungen dieser Faktoren in den untersuchten Gefäßsegmenten der SHR wurden durch die neonatale Sympathektomie nicht beeinflusst. Aus den Ergebnissen lässt sich ableiten, dass die Senkung des renalen Gefäßwiderstandes nach neonataler Sympathektomie bei SHR wahrscheinlich nicht auf einer geringeren Reaktivität der distalen Interlobararterien gegenüber den untersuchten Vasokonstriktoren, nicht auf einer vergrößerten Fähigkeit dieser Gefäße zur Vasodilatation und nicht auf einem verminderten Einfluss extrazellulärer Kalziumionen auf die Vasokonstriktion beruht. In den durchgeführten Versuchen waren keine Veränderungen in der Funktion der proximalen renalen Widerstandsgefäße nachweisbar, die zur Erklärung der antihypertensiven Wirkung der Nierentransplantate sympathektomierter spontan hypertensiver Ratten herangezogen werden können.
Die Transportproteine Multidrug Resistance-associated Protein (MRP) 1, MRP2, MRP3, MRP4 und P-Glykoprotein (Pgp) nehmen Schlüsselrollen bei der zellulären Detoxifikation und bei der Elimination harnpflichtiger sowie hepato-biliär ausgeschiedener Substanzen ein und zeichnen sich durch gemeinsame Substratspezifitäten aus. In der vorliegenden Arbeit wurde ein Kreuztransplantationsmodell der Nieren zwischen Lewis-1W-Ratten (Wildtyp) und kongenen MRP2-defizienten (MRP2[-/-]) Ratten etabliert, bei dem Wildtyp- und MRP2[-/-]-Ratten jeweils als Spender und als Empfänger dienten. Anhand dieses Modells konnten die Hypothesen untersucht werden, dass die renalen und hepatischen Transkriptgehalte von MRP1, MRP2, MRP3, MRP4 und Pgp bei nativen MRP2[-/-]-Ratten durch die MRP2-Defizienz (erste Hypothese), durch nierenspezifische MRP2-Defizienz (zweite Hypothese) und durch die Nierentransplantation an sich bei MRP2-defizienten Ratten stärker als bei Wildtyp-Ratten (dritte Hypothese) beeinflusst werden. Bei nativen MRP2[-/-]-Ratten wurden erhöhte hepatische MRP3- und Pgp-Transkriptgehalte sowie ein erniedrigter renaler Pgp-Transkriptgehalt gefunden. Nierenspezifische MRP2-Defizienz hatte keinen Einfluss auf die untersuchten Transkriptgehalte. Andererseits waren bei MRP2[-/-]-Empfängern die MRP1-Transkriptgehalte in der Niere höher und in der Leber niedriger als die bei Wildtyp-Empfängern unabhängig vom genetischen Hintergrund der transplantierten Nieren. Der Pgp-Transkriptgehalt transplantierter Wildtyp-Nieren war bei Wildtyp-Empfängern höher als bei MRP2[-/-]-Empfängern. Nach Transplantation von MRP2-/--Nieren war der hepatische MRP3-Transkriptgehalt bei MRP2[-/-]-Empfängern höher als bei Wildtyp-Empfängern. Bezüglich des hepatischen Pgp-Transkriptgehalts war es umgekehrt. Nach syngener Wildtyp-Nierentransplantation war im Vergleich zu nativen Wildtyp-Ratten lediglich der hepatische Pgp-Transkriptgehalt erhöht. Nach syngener MRP2[-/-]-Nierentransplantation waren die renalen MRP1- und MRP4-Transkriptgehalte höher und die hepatischen niedriger als die bei nativen MRP2[-/-]-Ratten. Der Pgp-Transkriptgehalt syngen transplantierter MRP2[-/-]-Nieren war höher als bei autochthonen Nieren nativer MRP2[-/-]-Ratten. Zusammenfassend konnte die MRP2-Defizienz der nativen MRP2[-/-]-Ratten auf transkriptionaler Ebene bestätigt werden. Durch die MRP2-Defizienz wurde die transkriptionale Regulation von MRP3 und Pgp bei nativen Ratten beeinflusst (erste Hypothese). Nach Nierenkreuztransplantationen wurden zwar keine Veränderungen auf transkriptionaler Ebene gefunden, publizierte Daten zum renalen MRP4-Proteingehalt geben jedoch Hinweise auf post-transkriptionale Regulationsmechanismen (Grisk et al., 2009). Außerdem scheint der genetische Hintergrund der Empfänger bei Transplantationen von Wildtyp- und MRP2[-/-]-Nieren für die untersuchten Transkriptgehalte von MRP1, MRP3 und Pgp von Bedeutung zu sein (zweite Hypothese). Die untersuchten Transkriptgehalte scheinen bei MRP2[-/-]-Ratten durch die syngene Nierentransplantation in größerem Umfang beeinflusst zu werden als bei Wildtyp-Ratten (dritte Hypothese).
The renal renin-angiotensin system (RAS) is involved in the development of chronic kidney disease. Here, we investigated whether mice with reduced renal angiotensin I-converting enzyme (ACE−/−) are protected against aristolochic acid nephropathy (AAN). To further elucidate potential molecular mechanisms, we assessed the renal abundances of several major RAS components. AAN was induced using aristolochic acid I (AAI). Glomerular filtration rate (GFR) was determined using inulin clearance and renal protein abundances of renin, angiotensinogen, angiotensin I-converting enzyme (ACE) 2, and Mas receptor (Mas) were determined in ACE−/− and C57BL/6J control mice by Western blot analyses. Renal ACE activity was determined using a colorimetric assay and renal angiotensin (Ang) (1–7) concentration was determined by ELISA. GFR was similar in vehicle-treated mice of both strains. AAI decreased GFR in controls but not in ACE−/− mice. Furthermore, AAI decreased renal ACE activity in controls but not in ACE−/− mice. Vehicle-treated ACE−/− mice had significantly higher renal ACE2 and Mas protein abundances than controls. AAI decreased renal ACE2 protein abundance in both strains. Furthermore, AAI increased renal Mas protein abundance, although the latter effect did not reach statistical significance in the ACE−/− mice. Renal Ang(1–7) concentration was similar in vehicle-treated mice of both strains. AAI increased renal Ang(1–7) concentration in the ACE−/− mice but not in the controls. Mice with reduced renal ACE are protected against AAN. Our data suggest that in the face of renal ACE deficiency, AAI may activate the ACE2/Ang(1–7)/Mas axis, which in turn may deploy its reno-protective effects.
Fokus der vorliegenden Arbeit war es, die Regulation des Aldosterons durch kaliumreiche Diät in Assoziation mit Expression und Funktion des AT2R in der NNR zu analysieren. Es wurde nachgewiesen, dass eine Renin-unabhängige Stimulation der Aldosteronsynthese durch die HKD in verschiedenen Tierstämmen (Sprague Dawley und transgene CxmAT2R- Ratten der Linie 235) mit Erhöhung der Expressionen des AT2R und der Proteinkinase p85α einhergehen. Die Ergebnisse über TASK-3 stellen die bisher publizierten Befunde in Frage, sodass eine abschließende Beurteilung der Lokalisation und Regulation offen bleiben muss. Wie erwartet, kam es nach Kaliumbelastung in allen untersuchten Tierstämmen zur Erhöhung der gemessenen Plasmakonzentration für Aldosteron bei annähernd gleichbleibenden Plasmareninkonzentrationen. Dieser Effekt konnte durch mRNA- Untersuchungen in der ISH bestätigt werden. Die relativen Expressionen des AT2R in der NNR ergaben für die SD und WT- Tiere signifikante Anstiege. Da die TGR des zweiten Experiments bereits eine basale Überexpression des AT2R aufwiesen, war hier keine weitere Stimulation des AT2R mehr zu verzeichnen. Die Bedeutung von Differenzierungsprozessen/ Steigerung der Proteinbiosynthese wird durch die nachgewiesene Stimulation der relativen Expression von p85α in beiden Experimenten nahegelegt. Weitere Ziele der Arbeit waren Untersuchungen zur Lokalisation des TASK-3- Kanals in der NN. Analog zur bekannten AS- Sequenz von TASK-3 wurden codierende Abschnitte mit geringer Homologie zu anderen Kaliumkanälen gewählt. Dabei konnte unabhängig von der Diät spezifische cDNA sowohl aus NNR und NNM amplifiziert werden. Auch in der ISH konnte TASK-3 im Bereich der ZG, ZF und in geringem Maße auch in weiter innen liegenden Schichten gefunden werden, sodass die Richtigkeit der bisher zu TASK-3 veröffentlichten Daten angezweifelt werden muss. Auf Proteinebene (IHC) zeigte sich eine kräftige Färbung im NNM sowie nur einzelne, gefärbte Zellnester ohne Zuordnung zu ZF bzw. ZG. Die Daten weisen darauf hin, dass TASK-3 in unterschiedlichem Maße in der gesamten Nebenniere exprimiert wird und die Regulation der relativen Expression nicht eindeutig durch Kalium reguliert oder funktionell mit dem AT2- Rezeptor assoziiert ist. Die im Rahmen der vorliegenden Arbeit erhobenen Daten betonen die Bedeutung der Regulation des RAAS durch kaliumreiche Diät für die Aldosteronproduktion und dessen funktionellen Zusammenhang mit Expressionen verschiedener Rezeptoren der Nebenniere. Von besonderem Interesse wird in zukünftigen Untersuchungen sein, inwieweit es Interaktionen zwischen AT2R, p85α, weiteren Adapterproteinen und den hyperpolarisierenden Kaliumkanälen auf intrazellulärer Signalebene sowie Liganden-abhängigen Signaltransduktionswegen gibt. Auch sollte der Einfluss lokaler Renin- Angiotensin- Systeme auf die Homöostase bei systemischer Applikation von Rezeptorantagonisten und –agonisten weiter untersucht werden. Das transgene CxmAT2R- Modell oder auch die Verwendung des kürzlich neu entwickelten AT2- Rezeptoragonisten (Compound 21) könnten in diesem Zusammenhang zu aufschlussreichen Erkenntnissen führen.
Beim Typ-1 Diabetes handelt es sich um eine multifaktorielle Autoimmunerkrankung, die auf dem Zusammenspiel genetischer, immunologischer und umweltbedingter Faktoren beruht. Hilfreich bei der Identifizierung krankheitsassoziierter Genloci sind diverse Tiermodelle, bei denen durch Kreuzungsstudien kongene Linien mit spontanen Rekombinationen im Bereich diabetes-suszeptibler oder diabetes-resistenter Genloci entstehen. Ein „Produkt“ solcher Kreuzungen ist die homozygote BB.6S m Rattenlinie, die obwohl Träger der diabetogenen Iddm1 und Iddm2 Genloci, nur eine T1D-Inzidenz von 10 % aufwies. Ursache für den diabetes-protektive Effekt war der alleinige chromosomale Austausch des diabetogenen Iddm4 Bereiches auf Chromosomen 6 der BB/OK Ratte durch den einer männlichen, diabetes-resistenten SH Ratte. Innerhalb dieser Arbeit sollten daher folgende Fragestellungen geklärt werden. 1. Ist die Iddm4 vermittelte Reduktion der Diabetesinzidenz auf die Expression eines oder mehrere potentieller diabetes-protektiver Gene zurückzuführen? 2. Wird das T1D Risiko durch den in diesem Bereich liegenden Imprintinglokus Dlk1-Dio3 beeinflusst? Zur Beantwortung dieser Fragen wurde eine zweite kongene Rattenlinie generiert. Die BB.6S f Linie, deren Iddm4 Genlocus von weiblichen SH Ratten abstammte, zeichnete sich wie die BB.6S m durch eine massive Reduktion der T1D Inzidenz aus. Nur 13 % der BB.6S f Ratten entwickelten einen T1D. Bei der Analyse der Expression von Strukturgenen konnten keine einheitlichen Muster zwischen BB.6S m und BB.6S f Ratten im Bezug zu BB/OK Ratten detektiert werden. Erst die Analyse des Expressionsmusters von mikroRNAs, deren Gene im Iddm4 Bereich und hier insbesondere im Dlk1-Dio3 Gencluster lokalisiert sind, ergaben sich Hinweise auf die mikroRNAs mir-337, mir-345 und mir-299 als potenzielle Kandidaten für einen T1D Schutz. Im zweiten Teil der Arbeit sollte geklärt werden, ob die T1D Inzidenz durch genomische Prägung der Gene des Dlk1-Dio3 Imprintingclusters beeinflusst wird: So sind auf dem väterlich vererbten Allel unter anderem die Gene Dlk1, Rtl1 und Dio3 aktiviert, während bei mütterlicher Abstammung Gtl2 und mikroRNAs exprimiert werden. Zur Klärung dieser Fragestellung wurden heterozygote F1 Hybride aus den Kreuzungen (BB/OK x BB.6S m) und (BB.6S m x BB/OK) generiert. Die phänotypischen Daten belegen, dass die heterozygoten Tiere in der Regel eine höhere T1D Inzidenz aufwiesen, die zusätzlich in Abhängigkeit vom Geschlecht der Nachkommen und dem Vererbungsmuster zwischen 21 und 74 % variierte. Generell waren weibliche Nachkommen besser vor einem T1D geschützt als männlichen Nachkommen. Außerdem zeigte sich, dass die T1D Inzidenz niedriger war, wenn das SHR Allels väterlicherseits vererbt wurde. Diese Sachverhalte deuten einerseits auf eine Interaktion des Iddm4 Bereichs von Chromosom 6 mit dem biallelischen X-Chromosom hin. Eine weitere Analyse der Dlk1 Expression belegt, dass es beim Fehlen des paternalen SHR Allels überraschenderweise zu einer biallelischen Expression des Dlk1 Genes kommt. Dieser Effekt ist assoziiert mit dem Verlust der Iddm4 vermittelten T1D Protektion. Die Daten der vorliegenden Arbeit lassen zusammenfassend drei Aussagen zu. I. Es konnte unter Einsatz der beiden kongenen BB.6S Rattenlinien kein Gen identifiziert werden, das den durch den Iddm4 Bereich der SH Ratte vermittelten Diabetesschutz bewirkt. II. Die Diabetesinzidenz wird offensichtlich durch Interaktion zwischen Chromosom 6 und dem biallelischen X-Chromosom beeinflusst. III. Hier konnte erstmals tierexperimentell bestätigt werden, dass die Manifestation eines T1D durch Imprinting geprägt wird.
In vorrausgegangen Studien konnte gezeigt werden, dass neonatale Sympathektomie bei SHR eine Senkung des arteriellen Mitteldrucks hervorruft. Es zeigte sich bei renalen Widerstandsgefäßen sympathektomierter SHR eine gesteigerte Noradrenalin-Sensitivität und eine vermehrte Vasokonstriktion nach spezifischer L-Typ-Ca2+-Kanalaktivierung. Die Mechanismen der Noradrenalin-Supersensitivität nach neonataler Sympathektomie sind Gegenstand der vorliegenden Arbeit. Ziel der durchgeführten Experimente war es, mögliche Veränderungen nach neonataler Sympathektomie in renalen und mesenterialen Widerstandsgefäßen zu charakterisieren und dabei auf eine Abhängigkeit vom Gefäßbett und Geschlecht zu untersuchen. Es wurden normotensive Wistar-Ratten verwendet, welche per Guanethidin-Injektionen und bilateralen Entfernung des Nebennierenmarks sympathisch denerviert worden und schein-sympathektomierte Kontrollen. Im Alter von 11-14 Wochen erfolgte die myographische Untersuchung der proximalen Widerstandsarterien von Niere und Mesenterium. Dafür wurden die distalen Interlobararterien der Niere und die 3. Generation von Aufzweigungen der Arteria mesenterica superior beider Geschlechter verwendet. Zusätzlich wurden diese Gefäße per real-time PCR auf die Expression verschiedener Gene untersucht. Die entnommenen isolierten Segmente der renalen und mesenterialen Widerstandsgefäße wurden zunächst hinsichtlich ihres Kontraktionsverhaltens myographisch untersucht. Dafür erstellten wir kumulative Konzentrations-Wirkungs-Kurven unter Gabe von Noradrenalin. Es zeigte sich bei renalen und mesenterialen Arterien der sympathektomierten Tiere eine signifikante Linksverschiebung der Konzentrations-Wirkungs-Kurve als Ausdruck einer gesteigerten Sensitivität der Gefäße auf Noradrenalin nach neonataler Sympathektomie. In einem zweiten myographischen Experiment untersuchten wir die Veränderungen der Gefäßantwort auf kumulative Stimulation mittels Noradrenalin unter L-Typ-Ca2+-Hemmung mittels Nifedipin. In diesem Experiment zeigte sich bei den renalen Arterien der sympathektomierten Tiere eine Rechtsverschiebung der Konzentrations-Wirkungs-Kurven. Dieser Effekt war an den mesenterialen Arterien nicht nachzuweisen. Im dritten Experiment untersuchten wir die Gefäße auf ihr Kontraktionsverhalten nach selektiver L-Typ-Ca2+-Aktivierung mittels S-(-)-BayK8644. Wir konnten dabei bei den renalen, aber nicht in den mesenterialen Arterien eine signifikante Vasokonstriktion bei den sympathektomierten Tieren nachweisen. Zur weiteren Untersuchung der Mechanismen, die zu dieser Noradrenalin-Supersensitivität führen, wurden im letzten Experiment Konzentrations-Wirkungs-Kurven für Noradrenalin unter ROCK-Inhibition mittels Y27632 erstellt. Es zeigte sich bei den renalen Arterien der sympathektomierten Gruppe eine signifikante Rechtsverschiebung der NA Konzentrations-Wirkungs-Kurven durch die Inhibition der ROCK. Dieser Effekt konnte für die mesenterialen Arterien nicht nachgewiesen werden. In den beschriebenen myographischen Experimenten ließen sich keine geschlechtsspezifische Unterschiede feststellen. Die renalen und mesenterialen Gefäße wurden anschließend noch in einer real-time PCR auf die Expression der ROCK-I, ROCK-II und der Cav1.2-Kanäle hin untersucht und auf die Haushaltsgene β-Actin und PBGD normiert. Es zeigte sich in der Gruppe der weiblichen sympathektomierten Tiere eine signifikant gesteigerte Expression der Cav1.2-Kanäle in den untersuchten Nierenarterien. In der Gruppe der männlich-sympathektomierten und den Mesenterialarterien beider Geschlechter zeigten sich keine Veränderungen in der Expression der ROCK oder der Cav1.2-Kanäle. Aus den Ergebnissen lässt sich schlussfolgern, dass neonatale Sympathektomie bei normotensiven Ratten zu einer gesteigerten Noradrenalin-Sensitivität der glatten Muskelzellen von renalen und mesenterialen Widerstandsarterien führt. Diese Noradrenalin-Supersensitivität zeigt eine Abhängigkeit vom Gefäßbett. In den renalen Arterien der sympathektomierten Tiere ließ sich eine gesteigerte Abhängigkeit der Noradrenalin-induzierten Vasokonstriktion von der ROCK und der Funktion der Cav1.2-Kanäle nachweisen. Hinweise auf geschlechtsspezifische Unterschiede nach neonataler Sympathektomie zeigten sich in der Expression der Cav1.2-Kanäle, welche in der Gruppe der weiblich sympathektomierten Tiere gesteigert waren.
Obwohl der Myokardinfarkt eine der häufigsten Todesursachen überhaupt ist, sind die zellulären und molekularbiologischen Pathogenesemechanismen und seine Therapiemöglichkeiten nicht ausreichend untersucht. Es ist bekannt, dass die Entzündungsreaktion für die Folgen eines Myokardinfarkts eine große Rolle spielt. In dieser Arbeit wurde ein Modell zur näheren Untersuchung grundlegender intrazellulärer und interzellulärer Mechanismen dieser Entzündungsreaktion entworfen. Es wurde ein in vitro Kokultursystem zwischen mononukleären Zellen (MNC) und Kardiomyozyten (H9c2 Zellen) etabliert. Damit konnten nicht nur bisher unbekannte Zellmechanismen aufgezeigt, sondern auch ein Modell zum Screening neuer therapeutischer Substanzen im Rahmen eines Myokardinfarkts entwickelt werden. So können beispielsweise neue Wirkstoffe für den Patienten sicherer gestaltet werden. Dieses Modell wurde durch die Simulation vieler bereits in vivo beschriebener Befunde im Rahmen eines Myokardinfarkts verifiziert. Dazu zählen die Verstärkung der Expression von ICAM‑1 auf Herzzellen sowie eine Erhöhung von ICAM‑1 und LFA‑1α auf MNC. Diese Befunde konnten mit dem entwickelten in vitro Kokultur‑Modell in Bezug auf Lymphozytensubpopulationen differenziert werden. Zusätzlich wurden Aussagen über LFA‑1α speziell auf B- und T‑Lymphozyten sowie auf H9c2 Zellen, über MHC Klasse I und II auf T‑Lymphozyten sowie auf H9c2 Zellen und über den Aktivierungsgrad der T‑Lymphozytensubopulationen getroffen. Durch die Kokultur von MNC mit H9c2 Zellen kommt es zu Veränderungen von Oberflächenstrukturen auf beiden Zelltypen. Es kann von einem erhöhten Aktivierungszustand der MNC nach der Kokultur ausgegangen werden, da die Expressionsdichte von Aktivierungsmarkern (IL‑2 Rezeptoren, MHC Klasse II) auf MNC durch die Kokultur von MNC mit H9c2 Zellen erhöht war. Die verstärkte Expression von ICAM‑1, LFA‑1α, MHC Klasse I und MHC Klasse II auf H9c2 Zellen sowie die erhöhten prozentualen Anteile an CTL und T‑Helferzellen und die erhöhten Expressionen von LFA‑1α und ICAM‑1 auf MNC durch die Kokultur lassen auf eine Interaktion zwischen mononukleären Zellen und Kardiomyozyten schließen. Insbesondere die Ergebnisse aus den an den H9c2 Zellen adhärierten MNC verstärken diesen Aspekt. Es gibt verschiedene Interaktionsmöglichkeiten zwischen MNC und H9c2 Zellen. Einerseits ist die Rezeptorbindung zwischen LFA‑1α auf MNC oder H9c2 Zellen und ICAM‑1 auf Kardiomyozyten oder MNC wichtig, andererseits spielt die Rezeptorbindung über MHC Klasse I/CD8 beziehungsweise über MHC Klasse II/CD4 eine Rolle. Durch die Kokultur wurde die erhöhte Produktion und Sekretion von proinflammatorischen Zytokinen und löslichen Mediatoren für TNF‑α, IL‑6 und NO gezeigt. Da H9c2 Zellen unter Kontrollbedingungen kein TNF‑α in das Kulturmedium freisetzten, wird deutlich, dass die gemessene erhöhte Menge an TNF‑α nach der Kokultur von MNC stammte. Andererseits konnte nicht geklärt werden, ob das erhöhte IL‑6 durch die MNC oder durch die H9c2 Zellen produziert wurde, da sowohl MNC als auch H9c2 Zellen in der Kultur unter Kontrollbedingungen geringe Mengen an IL‑6 freisetzten. Es muss davon ausgegangen werden, dass die erhöhte IL‑6 Konzentration aus der infolge der Kokultur vermehrten Produktion beider Zelltypen hervorgegangen ist. Aufgrund dessen, dass besonders IL‑6 für die Induktion der Expression von ICAM‑1 verantwortlich ist, scheint eine Signaltransduktion zwischen MNC und H9c2 Zellen von TNF‑α über IL‑6 und ICAM‑1 wahrscheinlich. H9c2 Zellen sowie MNC sezernieren unabhängig von der Kulturzeit eine geringe NO Menge, die durch die Kokultur gesteigert wurde. Durch eine längere Kokulturzeit wurde quantitativ nicht mehr NO sezerniert als bereits nach 24 Stunden, sodass geschlussfolgert werden kann, dass die NO Freisetzung besonders in der frühen Inflammationsphase eine Rolle spielt. Da IL‑6 erst verzögert nach 48 Stunden Kokultur verstärkt freigesetzt wird, TNF‑α aber bereits nach 24 Stunden ein Maximum im Kulturüberstand erreichte, wird die Induktion der NO Freisetzung eher auf TNF‑α oder andere proinflammatorische Zytokine, nicht aber auf IL‑6 zurückzuführen sein. Es ist nicht bekannt, ob NO durch IL‑6 induziert werden kann. Mit Hilfe durchflusszytometrischer und molekularbiologischer Auswertung konnte ein lokales RAS in den MNC nachgewiesen werden. In der mRNA Analyse wurden sowohl AT1AR als auch AT1BR detektiert. Ebenso wurde in den MNC der F344 Ratten mRNA für Angiotensinogen, AT2 Rezeptoren, ACE, Renin und Exon 1A Renin nachgewiesen. Renin, AOGEN und ACE von sMNC, die mit Hilfe einer quantitativen PCR untersucht wurden, werden durch die Kokultur von MNC und H9c2 Zellen signifikant vermindert. Der Anteil AT1R positiver Zellen verminderte sich durch die Kokultur von MNC mit H9c2 Zellen und die AT2 Rezeptordichte auf sMNC und speziell auf T‑Lymphozyten erhöht sich. Jedoch spiegelt die Kokultur nicht in allen Parametern die Aktivierung des lokalen RAS innerhalb der nicht adhärierten MNC wieder. Die adhärierten MNC waren für die PCR Untersuchung nicht zugänglich. Es bleibt offen, inwieweit es zur Aktivierung des lokalen RAS in MNC durch die Kokultur kommt. Da sowohl sMNC als auch PBMC über alle RAS-Komponenten zur Generierung von ANG II verfügen, kann geschlussfolgert werden, dass sie ein lokales Renin‑Angiotensin‑System besitzen. Es können durch die Kokultur bedingte Veränderungen hinsichtlich der Oberflächenexpression einiger Strukturen durch den Einsatz von spezifischen Hemmstoffen des RAS vermindert oder aufgehoben werden. Dieser Effekt ist ein Indikator dafür, dass das lokale RAS in der Kokultur von MNC mit H9c2 Zellen eine wichtige Rolle spielt. Beispielsweise verminderte der AT1 Rezeptorblocker DUP753 signifikant den prozentualen Anteil an LFA‑1α und ICAM‑1 exprimierenden T‑Lymphozyten. Zusätzlich kam es zur Verminderung der Dichte von MHC Klasse II Oberflächenmolekülen auf T‑Lymphozyten und der IL‑2 Rezeptordichte auf CTL gegenüber den ohne Inhibitor kokultivierten Zellen. Diese Befunde lassen auf einen geringeren Aktivitätszustand der MNC und auf eine schwächere Interaktion zwischen MNC und H9c2 Zellen durch Behandlung mit einem AT1 Rezeptorblocker schließen. Dies ist ein Indiz dafür, dass das lokale RAS der MNC in der Kokultur von MNC und H9c2 Zellen aktiviert wird. Im Gegensatz dazu lässt sich die durch die Kokultur bei H9c2 Zellen induzierte Apoptose und Nekrose durch AT1R und AT2R Blockade nicht verhindern. Dieses Modell ist geeignet, zelluläre und molekulare Prozesse des Myokardinfarkts zu simulieren. Es könnte künftig ein wichtiger Bestandteil des Arzneimittelscreenings der Herzinfarkttherapie darstellen und als Grundlage für weitere Studien in der Behandlung des Myokardinfarktes dienen. Zur Optimierung dieses Modells sollte eine Methode etabliert werden, die es ermöglicht, die adhärierten MNC von den H9c2 Zellen zu trennen, um sie molekularbiologisch untersuchen zu können.
Erhöhte Plasma-Prorenin- und Plasma-Aldosteron-Konzentrationen werden mit der Entwicklung kardialer Endorganschäden in Verbindung gebracht. Beim transgenen Cyp1a1ren-2 Tiermodell sind durch Variation des auf enteralem Wege verabreichten Prorenin-Transgen-Induktors Indol-3-Carbinol (I3C) die Prorenin-Sekretion und in der Folge die Aldosteron-Sekretion sowie die Höhe des Blutdrucks titrierbar. Ziel der vorliegenden Arbeit war es zu untersuchen, ob die Hypertonie bei Cyp1a1ren-2 transgenen Ratten (TGR) mit einer kardialen Fibrose bzw. Inflammation einhergeht. TGR und transgen-freie Fischer-F344-Ratten (F344) erhielten für zwei bzw. zwölf Wochen I3C (0,167 bzw. 0,125 %). Die Plasma-Prorenin-, -Renin-, und -Aldosteron-Konzentrationen wurden bestimmt. Im linken Ventrikel wurde mittels real-time RT-PCR der mRNA-Gehalt kardialer Marker für Hypertrophie und Fibrose (Transforming growth factor-ß1 [TGF-ß1], Endothelin-1 [ET1], Kollagen Typ 3 [Col3]), oxidativen Stress (funktionelle Untereinheit der Nicotinamid-Adenindinucleotidphosphat-Oxidase [gp91phox]), und Inflammation (Interzelluläres Adhäsionsmolekül-1 [ICAM1]) bestimmt. Außerdem wurde das Ventrikelgewebe histologisch untersucht. I3C-Gabe führte bei TGR zu einer moderaten kardialen Hypertrophie ohne histologische Anzeichen einer Fibrose oder Inflammation. Zweiwöchige I3C-Gabe führte bei TGR zu einem Anstieg der Plasma-Prorenin- (70-fach), und -Aldosteron- Konzentration (4,6-fach) sowie des kardialen mRNA-Gehaltes von Col3 und gp91phox. Bei zwölfwöchiger I3C-Gabe war die Plasma-Prorenin-Konzentration bei TGR sogar ca. 260-fach und die Plasma-Aldosteron-Konzentration ca. 4-fach gegenüber dem Ausgangswert erhöht. Beide Parameter blieben bis zum Ende der zwölfwöchigen Behandlung erhöht. Die Plasma- Renin-Konzentration war hingegen nach vier Wochen I3C auf ca. 25% des Ausgangwertes erniedrigt und blieb bis Versuchsende auf diesem Niveau. Der kardiale mRNA-Gehalt von TGF-ß1, ET1, gp91phox und ICAM1 war nach zwölfwöchiger I3C-Gabe bei TGR erhöht, während zwölfwöchige I3C-Gabe bei F344 zu einer Abnahme des kardialen mRNA-Gehaltes von ET1 und gp91phox führte. Die Ergebnisse dieser Arbeit zeigen, dass ein Hyperaldosteronsimus und eine bis zu 260- fach erhöhte Plasma-Prorenin-Konzentration bei TGR in einem Modell der chronischen, nicht-malignen arteriellen Hypertonie keine fibrotischen und inflammatorischen Veränderungen am linken Ventrikel erzeugen.
Die zerebrale Ischämie zählt weltweit zu den wichtigsten kardiovaskulären
Erkrankungen und bedarf einer kontinuierlichen Optimierung der Prävention und der
Therapie. Das Renin-Angiotensin-System (RAS) ist ein mögliches therapeutisches
Target, da die Angiotensin-vermittelte Initiation fibrotischer und nekrotischer
Prozesse sowie die Bildung reaktiver Sauerstoffspezies (ROS) die Genese diverser
kardiovaskulärer und neurologischer Erkrankungen begünstigt. Die kürzlich
entdeckten alternativen Renintranskripte, die ein Bestandteil lokaler RAS z.B. des
zentralen Nervensystems (ZNS), des Herzens und der Lunge sind, könnten von
Bedeutung sein. So werden dem alternativen zytosolischen Renintranskript
(Ren[1a-9]) am Herzen unter ischämierelevanten Bedingungen anti-nekrotische und
zytoprotektive Effekte attestiert. Daher ergab sich die übergeordnete Fragestellung,
wie die Expression der Renintranskripte im ZNS in Abhängigkeit von
ischämierelevanten Bedingungen reguliert wird und welche Bedeutung das lokale
RAAS des Gehirns innehat. Die Grundvoraussetzung der angestrebten
Untersuchungen bildete die Etablierung eines geeigneten neuronalen Zellmodells. Im
Anschluss wurden die basale Reninexpression und deren Abhängigkeit vom
Zellzyklus und dem Differenzierungsgrad der Zellen untersucht. Abschließend
erfolgte die Analyse der Reninexpression und deren Regulation nach Kultivierung der
Zellen unter Glukose- und Sauerstoffdepletion.
Im Rahmen dieser Arbeit konnten die adhärenten PC12 Zellen als zentrales
Zellmodell etabliert werden, um die molekularen Mechanismen und die funktionellen
Zusammenhänge der Reninexpression in neuronalen Zellen zu untersuchen. Die non
adhärenten PC12 Zellen eignen sich für diese Zwecke nicht. Die mHippo18 Zellen
sind für die funktionellen Analysen des sekretorischen Renintranskripts zu
empfehlen. In Abhängigkeit von der Zellzyklusphase war eine Regulation der Renintranskripte
zu beobachten. Der Übergang der stationären und der NGF-stimulierten
Zellen in die G0/G1-Phase korrelierte mit einer Induktion der exprimierten Renintranskripte.
Die zugrunde liegenden Mechanismen bleiben durch weiterführende
funktionelle Analysen zu klären. Abschließend war in den PC12 Zellen eine
Stimulation der zytosolischen Reninexpression unter OGD nachzuweisen. Insgesamt
legen die Ergebnisse dieser Arbeit eine mögliche Relevanz des intrazellulären RAS
für das Verständnis und die Therapie der zerebralen Ischämie nahe.
Etablierung neuer Modelle der Expressionsminderung zur funktionellen Analyse des (Pro)Reninrezeptors
(2014)
Im Rahmen der Promotionsarbeit wurden Modelle der Expressionsminderung für In-vitro-Studien zur Wirkung des (Pro)Renin-Rezeptors ((P)RR) etabliert und Analysen hinsichtlich möglicher Effekte auf pH-Werte in Organellen im Vergleich zu den Effekten des spezifischen V-ATPase-Blockers Bafilomycin A durchgeführt. Einerseits erfolgte ein induzierter Knock-out mittels Cre/loxP-System bei embryonalen Fibroblasten der Maus (MEF), andererseits wurde als mildere Alternative eines konsequenten Knock-out eine transiente Downregulation mittels siRNA smart Pool bei Renin sezernierenden As4.1-Zellen durchgeführt. Anhand beider Modelle konnte nachgewiesen werden, dass sich eine Expressionsminderung des (P)RR sowie ein V-ATPase-Block mittels Bafilomycin A1 negativ auf das Zellüberleben und auf die Proliferation der Zellen auswirkte. Bei den (P)RR-Knock-out-MEF kam es zu keinen pH-Wert-Veränderungen, während unter der Behandlung mit Bafilomycin A1 als Ursache für das Zellsterben eine eindeutige pH-Wert-Erhöhung in späten Endosomen und Lysosomen ausgemacht werden konnte. Sekretionsanalysen zur basalen Renin- und Proreninfreisetzung und Analysen zum jeweiligen Proteingehalt der As4.1-Zellen zeigten in den (P)RR-Knock-down-Zellen keine Veränderungen. Nur der spezifische Block der V-ATPasen mittels Bafilomycin A führte zu einer gesteigerten Rate der basalen Reninfreisetzung. Untersuchungen saurer Organellen der As4.1-Zellen ergaben hingegen interessante Ergebnisse: Während ein V-ATPase-Block erwartungsgemäß zu einer geringen Fluoreszenzintensität der pH-sensitiven Farbstoffe Lysosensor und Lysotracker führte, nahm die Intensität in (P)RR-Knock-down-Zellen überraschenderweise zu. Aus diesem gegensinnigen Effekt ließe sich die Hypothese ableiten, der (P)RR sei ein natürlicher Inhibitor der V-ATPase. Die direkte Interaktion beider Proteine und die Hemmung der V-ATPase-Aktivität durch den (P)RR/ATP6ap2 bleiben jedoch durch funktionelle Analysen zu überprüfen. Die Arbeit trägt mit der Etablierung neuer Modelle der (P)RR-Depletion sowie mit den Daten zu pH-Werten in Organellen zur Aufklärung der Wirkungen des (Pro)Renin-Rezeptors bei.
Zahlreiche Studien liefern Erkenntnisse über den Zusammenhang zwischen reaktiven Sauerstoffspezies und der Entstehung kardiovaskulärer Erkrankungen, wie der Hypertonie. Besonders NADPH-Oxidase-abhängige Sauerstoffradikale wurden als wichtige krankheitserzeugende Faktoren in der Entwicklung und Aufrechterhaltung kardiovaskulärer Erkrankungen, wie der arteriellen Hypertonie identifiziert und Substanzen erforscht, die zu experimentellen und therapeutischen Zwecken die NADPH-Oxidase-Aktivität hemmen. Das Ziel dieser Arbeit bestand darin, durch frühzeitige Behandlung spontan hypertensiver Ratten mit einer Substanz, die NADPH-Oxidase-hemmende Eigenschaften hat, eine langfristige Blutdrucksenkung und eine Verbesserung der endothelvermittelten Vasodilatation zu erreichen. Dazu wurde eine Gruppe von 8 SHR über das Trinkwasser mit dem NADPH-Oxidase-Hemmer Apocynin behandelt und mit Hilfe der Radiotelemetrie der systolische, diastolische Blutdruck sowie die Herzfrequenz registriert. Die Apocynin-behandelten SHR wurden mit einer Gruppe von 6 unbehandelten SHR-Kontrolltieren verglichen. Neben diesen Experimenten wurden Untersuchungen zur Endothelfunktion Apocynin-behandelter SHR an isolierten renalen Interlobar- und Koronararterien und zur vasodilatierenden Wirkung von Apocynin an Interlobar- und Koronararterien von F344 Ratten mit einem Small-Vessel-Myographen durchgeführt. Die Ergebnisse dieser Arbeit konnten zeigen, dass die Behandlung der SHR mit Apocynin bis zur 8. Lebenswoche keine langfristige Blutdrucksenkung zur Folge hatte. Der Vergleich beider Gruppen hinsichtlich der Blutdrücke ergab keinen statistisch signifikanten Unterschied. Die Untersuchungen zur endothelvermittelten Vasodilatation mit Acetylcholin an isolierten renalen Interlobar- und Koronararterien Apocynin-behandelter und unbehandelter SHR zeigten, dass durch die Behandlung der SHR mit Apocynin keine Verbesserung der renalen und koronaren Endothelfunktion im Vergleich zu den Kontrollen resultierte. Die Experimente zur Klärung der Mechanismen, die die vasodilatierende Wirkung von Apocynin vermitteln ergaben, dass durch die Hemmung der NADPH-Oxidase-abhängigen Sauerstoffradikale, durch die Abwesenheit von extrazellulärem Kalzium, durch Kalium und durch die Inhibition der Proteinkinase A und G die Apocynin-induzierte Vasodilatation nicht signifikant gehemmt wurde. Durch die Inkubation der Arteriensegmente mit dem Rho-Kinase-Hemmer Y-27632 wurde die Vasopressin-induzierte Vasokonstriktion signifikant abgeschwächt und die kumulative Zugabe von Apocynin zeigte keine zusätzliche Wirkung auf die Wandspannung. Diese Ergebnisse belegen, dass die renalen Interlobar- und Koronararterien von SHR und F344 Ratten auf Apocynin mit einem ausgeprägten Dilatationsverhalten reagierten, die Vasodilatation jedoch nicht über eine Hemmung der NADPH-Oxidase, vermutlich aber über eine Hemmung der Rho-Kinase vermittelt wird.
In früheren Studien gelang der Nachweis der Expression eines alternativen Renin-Transkripts im kardialen Gewebe, dessen Konzentration nach Eintritt eines Herzinfarktes deutlich anstieg. Das Ziel der vorliegenden Arbeit ist die Untersuchung der Funktionalität dieses alternativen Renin-Transkripts, mit besonderem Augenmerk auf den Einfluss des Renins hinsichtlich Wachstum und Metabolismus von Herzzellen. In Abhängigkeit vom jeweiligen Promotor des kardialen Renin-Gens enstehen zum einen das sekretorische Exon(1-9)Renin und zum anderen das nicht sekretorische Exon(2-9)Renin, welches zytosolisch gebildet und in der mitochondrialen Fraktion gespeichert wird. Die funktionellen Bedeutungen des nicht-sekretorischen Renins sind bisher nicht gesichert. Aus früheren Beobachtungen ist jedoch bekannt, dass nach einer kardialen Ischämie die Konzentrationen der nicht-sekretorischen Renin-Transkripte erhöht sind und somit hypothetisch von einem Einfluss auf postischämische Prozesse ausgegangen werden kann. Zur Untersuchung dieser Hypothese etablierten wir mittels der H9c2-Zelllinie ein geeignetes Zellmodell, welches uns durch Überexpression der Exon(1A-9)Renin-, Exon(2-9)Renin-bzw. Exon(1-9)Renin-Transkripte die Möglichkeit gab, funktionelle Besonderheiten der Prorenine auf Rattenherzzellen zu untersuchen. Dabei konnte eindrucksvoll belegt werden, dass die unterschiedliche Lokalisation der Prorenine die Funktionalität der Kardiomyoblasten massgeblich beeinflusst. So führte die Exon(1-9)Renin-Überexpression zu Veränderungen der metabolischen Aktivität, Hypertrophie und Nekrose. Im Gegensatz dazu kam es bei der Exon(2-9)Renin-Überexpression eher zum Schutz vor Nekroseprozessen. Die beobachteten Effekte lassen sich dabei sowohl bei den Exon(2-9)Renin- als auch bei den Exon(1-9)Renin-transfizierten Zellen auf eine direkte, ANG II-unabhängige Wirkung zurückführen. Das sekretorische Prorenin kann zweifelsfrei pro-inflammatorisch, pro-apoptotisch, pronekrotisch und damit schädigend wirken. Die vorliegende Arbeit weist jedoch nach, dass vom selben Renin-Gen, welches für dieses sekretorische Prorenin kodiert, ein zweites Transkript abgelesen wird, dessen Exon(2-9)Renin intrazellulär verbleibt und antinekrotisch (und damit protektiv) wirkt.
Die neonatale sympathische Denervierung steigert die Agonist-induzierte Gefäßkontraktion. Dieser Effekt kommt möglicherweise durch modifizierte Signaltransduktionsmechanismen zustande. Dazu könnten Veränderungen in Rho-Kinase(ROCK)- und L-Typ-Ca2+-Kanalabhängigen Signalwegen gehören, welche den Rezeptoren der vasoaktiven Agonisten nachgeschaltet sind. In der vorliegenden Studie wurde untersucht, ob die verstärkte
Aktivierung der ROCK und/oder L-Typ-Ca2+-Kanäle zur gesteigerten
Noradrenalin(NA)-induzierten Gefäßkontraktion bei renalen Widerstandsgefäßen neonatal sympathektomierter Ratten beitragen. Für die experimentellen Untersuchungen wurden normotensive männliche Wistar-Ratten (Crl:Wi) verwendet. Diese wurden neonatal sympathektomiert oder scheinsympathektomiert. Es folgte die Untersuchung isolierter renaler
Widerstandsarterien 9 bis 12 Wochen alter Tiere mittels Small-Vessel-Myographie. Die Expression der L-Typ-Ca2+-Kanäle isolierter renaler Widerstandsgefäße wurde mittels Western-Blot untersucht. Zusätzlich wurde das Ruhemembranpotential der glatten Gefäßmuskelzellen mittels Mikroelektroden registriert. Die neonasale sympathische Denervierung führte im Vergleich zur Scheinsympathektomie zu einer gesteigerten NA-Sensitivität bei Gefäßen normotensiver Ratten. Sowohl die Inhibition der ROCK als auch die Blockade von L-Typ-Ca2+-Kanälen führte zur Rechtsverschiebung der NA-Konzentrations-Wirkungs-Kurve. Diese Effekte waren bei Gefäßen sympathektomierter Tiere im Vergleich zu scheinbehandelten Kontrollen deutlicher ausgeprägt. L-Typ-Ca2+-Kanalaktivierung mittels
S-(-)-BayK8644 löste bei Nierenarterien sympathektomierter Ratten starke
Gefäßkontraktionen aus. Die Gefäße der Kontrollen reagierten hingegen nur schwach auf S-(-)-BayK8644. Der Proteingehalt der a1-Untereinheit der L-Typ-Ca2+-Kanäle glatter Gefäßmuskelzellen unterschied sich nicht zwischen beiden Gruppen. Das Ruhemembranpotential glatter Gefäßmuskelzellen unterschied sich statistisch signifikant zwischen beiden Gruppen (p < 0,05) und betrug –57,5 ± 2,2 mV bei renalen Widerstandsgefäßen sympathektomierter Tiere und –64,3 ± 0,3 mV bei Kontrollen. Die Depolarisation der glattmuskulären Zellmembran durch kaliumreiche Organbadlösung steigerte die S-(-)-BayK8644-induzierte Kontraktion der Gefäße sympathektomierter Tiere und löste Kontraktionen bei Gefäßen der Kontrolltiere aus. Die Aktivierung von KATP-Kanälen führte zum vollständigen Verschwinden der S-(-)-BayK8644-induzierten Kontraktion bei Gefäßen
sympathektomierter Tiere. Diese Befunde zeigen, dass die sympathische Denervierung renaler Gefäße zu einer Depolarisation des Membranpotentials der Gefäßmuskelzellen führt, die zu einer gesteigerten Aktivierbarkeit L-Typ-Ca2+-Kanal-abhängiger Signalwege beiträgt.
Einfluss der Kochsalzaufnahme auf die renale Genexpression von Komponenten des Endothelinsystems
(2011)
In der vorliegenden Studie wurde das renale Endothelinsystem auf Genexpressions- und Peptidebene bei Variation der diätetischen Kochsalzaufnahme in physiologisch relevanten Größenordnungen bei der Sprague-Dawley-Ratte ubtersucht. Das Ziel war eine systematische Darstellung der Veränderungen der wichtigsten Komponenten des Endothelinsystems mit einer differenzierten Betrachtung von Nierenrinde und Nierenmark. Dazu wurde in einer ersten experimentellen Serie der Kochsalzgehalt der zugeführten Nahrung zwischen 0,15% und 1,80% variiert. Um den Einfluss des Renin-Angiotensin-Systems auf kochsalzinduzierte Veränderungen des renalen Endothelinsystems zu untersuchen, wurde ein Teil der Tiere mit dem AT1-Rezeptorblocker Losartan behandelt. Es wurden simultan Herzfrequenz, arterieller Blutdruck und die renale Na+-Bilanz bei den Tieren gemessen und am Ende des Experimentes die Nieren gewonnen. Anschließend erfolgten die Bestimmung der mRNA-Gehalte von Prä-pro-ET-1, des ETA- und ETB-Rezeptors sowie des renalen immunreaktiven ET-1-Gehaltes. Zur besseren Lokalisierung und Präzisierung der gefundenen Veränderungen schlossen wir eine zweite experimentelle Serie an, in der eine feinere Präparation des Nierenmarks in äußere und innere Medulla, eine weitere Verringerung des Kochsalzgehaltes der Niedrigsalzgruppe (0,05%) sowie eine Erweiterung der Genexpressionsuntersuchungen um das Endothelin-Converting-Enzym-1 (ECE-1) erfolgte. Die Ergebnisse der Studie lassen sich wie folgt zusammenfassen: Die Variation der Salzdiät beeinflusste weder den arteriellen Blutdruck noch die Herzfrequenz der Tiere. Hinsichtlich der Genexpression war eine Niedrigsalzdiät von 0,15% NaCl mit einem Anstieg der mRNA-Expression von Prä-pro-ET-1 (51%), des ETA- (81%) und ETB- Rezeptors (33%) sowie mit einem erhöhten immunreaktiven ET-1-Gehalt (110%) im gesamten Nierenmark assoziiert. In der weiterführenden Untersuchung unter 0.05% NaCl konnte dieser Effekt auf der Genexpressionsebene in der äußeren Medulla reproduziert werden, allerdings in milderer Ausprägung (Prä-pro- ET-1 37%, ETA 20%, ETB n. sign., ECE-1 16%). Diese Diäteffekte ließen sich durch eine selektive AT1-Rezeptorblockade mittels Losartan teilweise bzw. vollständig aufheben. Der renale Cortex blieb durch Variation der Kochsalzaufnahme sowohl hinsichtlich der mRNA-Expression der einzelnen Komponenten des Endothelinsystems als auch hinsichtlich des immunreaktiven ET-1-Gehaltes weitgehend unbeeinflusst. Daraus lässt sich schlussfolgern, dass vorwiegend das medulläre Endothelinsystem sowohl auf Transkript- als auch auf Peptidebene auf moderate Veränderungen der nutritiven Kochsalzaufnahme reagiert. Die signifikanten Veränderungen auf Genexpressionsebene betreffen dabei Prä-pro-ET-1 und den ETA-Rezeptor insbesondere in der äußeren Medulla unter Niedrigsalzdiät. Diese Alterationen werden zumindest partiell durch AT1-Rezeptoren vermittelt.
Der (Pro)Renin Rezeptor ((P)RR, auch ATP6ap2) wurde 2002 als membranständiges Protein entdeckt. Seitdem treten neben dem Renin-Angiotensinogen-Angiotensin System (RAAS) immer mehr Signalwege zu Tage, die von der Funktion des (P)RR abhängen. Hierzu zählen neben dem kanonischen Wnt – pathway und dem nicht kanonischen Wnt-PCP (planar cell polarity) auch ein Einfluss auf vesikuläre ATPasen und Transkriptonsfaktoren (PLZF Erk1/2). Wegen frühzeitig letaler Verläufe unter vollständiger (P)RR Elimination in vivo bleibt mit einer moderaten Verminderung der Expression (Downregulation) ein Weg, um die Relevanz und Beteiligung des Rezeptors weiter zu untersuchen. In der tumorösen renalen Zelllinie As4.1 wurde hierzu durch die AG Peters eine selektive (P)RR Downregulation etabliert. Die hierunter erfolgte unselektive Analyse des gesamten Transkriptoms zeigte 28 relevante Änderungen der Transkriptkonzentrationen, dessen zugehörige Genprodukte sich funktionell in zwei Gruppen teilen lassen. Einerseits waren mehrere Zilien assoziierte Transkripte nach (P)RR Downregulation erhöht, andererseits waren Zellzyklus assoziierte Transkripte vorrangig vermindert. Hieraus ergaben sich als Zielstellungen für die Arbeit:
1.) eine erneute gezielte und statisisch belastbare Überprüfung der zuvor veränderten Transkriptkozentrationen unter (P)RR Downregulation, 2.) eine funktionelle Untersuchung des Zusammenhangs von (P)RR zur ziliären Expression und dem Zellzyklus, 3.) die Analyse möglicher vermittelnder Signalwege.
Durch molekularbiologische und funktionelle Untersuchungen, Flureszenszmikroskopie und FACS Analysen, wurden im Rahmen dieser Arbeit (ad 1) die Transkriptveränderungen bestätigt, (ad 2) eine relevant verminderte Proliferationsrate und ein Zellzyklusarrest, bei gleichzeitig erhöhter Expression des primären Ziliums unter (P)RR Downregulation nachgewiesen, sowie (ad 3) Transkriptmengen Steigerungen des kanonischen und Wnt-PCP gemessen.
Ohne Analyse der zugehörigen Proteinmengen lässt sich aus den Ergebnissen nur vorsichtig schlussfolgern, dass der (P)RR (ad 1) möglicherweise im Aufbau des primären Zilium und/oder in der Entstehung von Ziliopathien beteiligt ist, (ad 2) eine (P)RR Downregulierung den Zellzyklus protrahiert und die Expression des primären Ziliums verstärkt und (ad 3) die Wnt-Signalwege dies vermitteln könnten. Neben dem ausstehenden Nachweis auf Proteinebene wäre ein gezielter Vergleich von primärem Zilium (fast ubiquitär, Zellzyklus abhängige Expression) gegenüber den spezialisierten Zilien der symptomatischen Ziliopathien (Retinitis pigmentosa, Polyzystische Nierenerkrankung) interessant, wobei in der Einordnung der Ergebnisse die Sonderrolle der hier gewählten Zellkultur (As4.1, renale Tumorlinie) berücksichtigt werden muss.
Effekte einer Überexpression von Angiotensin II Typ 2 Rezeptoren in der Nebenniere von Ratten
(2010)
Die Kontrolle der Aldosteronbiosynthese in der ZG der Nebenniere wird hauptsächlich über den AT1R vermittelt. Die Funktion des AT2R hingegen, der in geringerem Ausmaß ebenfalls in der ZG exprimiert wird, ist weitgehend ungeklärt. Zur Untersuchung der Rolle des AT2R bei der AT1R-vermittelten Aldosteronbiosynthese wurde ein transgenes Rattenmodell entwickelt, dass Maus-AT2R in der Nebenniere, im Herz, Gehirn, Skelettmuskel, in Gefäßen und Niere überexprimiert. Mittels nicht radioaktiver ISH konnte eine starke Überexpression von Maus-AT2R in der ZG nachgewiesen werden. Nach Stimulation des RAS mit exogen zugeführtem ANGII in einem 2-wöchigen Tierexperiment, konnte ein schnellerer und stärkerer Anstieg der PAK gemessen werden und somit ein inhibitorischer Effekt des AT2R auf die Aldosteronproduktion ausgeschlossen werden.
Mehr als 20 Jahre Forschung zu Inkretinen führten zu neuen Klassen von Antidiabetika, den Inkretin Analoga und den DPP-4-Hemmern, die die biologische Halbwertzeit von GIP (Glucose dependent insulinotropic polypeptide) und GLP-1 (Glucagon-like-peptide-1) verlängert. Noch sind zahlreiche Fragen bezüglich der Effekte der beiden Inkretin Hormone GIP und GLP-1 bei gesunden Personen und diabetischen Patienten offen. Derzeit vorliegende Studien erlauben bisher nur einen sehr begrenzten direkten Vergleich zur insulinogenen Wirkung der beiden Inkretine. Die insulinogenen Wirkungen von GIP und GLP-1 wurden im Rahmen der vorliegenden Arbeit im direkten Vergleich in normoglykämischen und hyperglykämischen Ratten Modellen untersucht. Es wurde ein experimentelles Testmodell entwickelt, um die Dosis-abhängige Insulin-Antwort nach GIP und GLP-1 Injektion unter vergleichbaren Bedingungen messen zu können. Für GIP und GLP-1 konnte eine dosisabhängige Stimulation der Insulinsekretion unter Normoglykämie dokumentiert werden. GIP erwies sich als stärker insulinogen als das GLP-1. Bei ihrer Applikation vor dem standardisierten IVGTT (Intravasaler Glukose Toleranz Test) wirkten die Inkretine dosisabhängig insulinogen. Als äquipotente Dosen im IVGTT wurden 2 nmol/kg GIP und 4 nmol/kg GLP-1 identifiziert, belegt durch vergleichbare Glukose- und Insulinüberschreitungsflächen und einen vergleichbaren insulinogenen Index. Der durch die Inkretingabe erhöhte Glukoseabstrom war nach 2 nmol/kg GIP doppelt so hoch als nach 4 nmol/kg GLP-1 Gabe. Die kombinierte Gabe von GIP und GLP-1 induzierte eine im Vergleich zur Einzelapplikation stärkere biphasische Insulinfreisetzung. In einem nächsten Schritt wurde die insulinogene Wirkung der equipotenten Dosen GIP und GLP-1 unter systemischer DPP-4-Hemmung in Wistar Ratten untersucht. Dazu wurden 20 min vor dem Test 30 µmol/kg des DPP-4-Hemmers P32/98 oral verabreicht. Die Unterbindung der Inkretininaktivierung induzierte differente insulinogene Wirkungen von 2 nmol/kg GIP und 4 nmol/kg GLP-1. Während die DPP-4-Hemmung die durch das das GIP induzierte Insulinausschüttung, den insulinogenen Index und den Glukoseabstrom weiter verstärkte und die Glukosetoleranz verbesserte, führte sie nahezu zum Verlust der insulinogenen Potenz von GLP-1. Der Wirkungsverlust des GLP-1 unter systemischer DPP-4-Hemmung gab Anlass, den GLP-1 Metaboliten hinsichtlich eigener Wirkungen zu untersuchen. Die Gabe des GLP-1 Metaboliten vor dem IVGTT wies auf eine schwache eigene insulinogene Wirkung hin. Die durch die DPP-4-Hemmergabe induzierte Reduktion des Inkretineffektes von 4 nmol/kg intaktem GLP-1 (GLP-1 (7-36) amid) konnte durch die Kombination mit dem GLP-1 Metaboliten (GLP-1 (9-36)) nur gemindert werden. Bei hyperglykämischen ZDF Ratten induzierten 2 nmol/kg GIP und 4 nmol/kg GLP-1 einen vergleichbar großen Anstieg der Insulinkonzentrationen im Plasma. Dieser Anstieg fiel aber bei den hyperglykämischen Tieren geringer (3-fach) als bei den Wistar Ratten (5-fach) aus. Die Anstiege der Insulinkonzentrationen im Plasma hatten in den ZDF Ratten keine Blutglukose senkende Wirkung. Insgesamt wurde im Vergleich mit den Daten aus der Literatur noch einmal unterstrichen, dass die Form der Applikation von GIP und GLP-1 für deren insulinogene Wirkung von entscheidender Bedeutung ist. Bolusgaben, d.h. ein kurz anhaltender Stimulus und Infusionen von GIP und GLP-1 induzieren jeweils spezifische Wirkungen, die beim therapeutischen Einsatz von Bedeutung sein können. Die intravasalen Applikationen von GIP und GLP-1 als Boli über 10 Tage ergaben für das GLP-1 erwartete und bereits bekannte Effekte, für das GIP aber neue Erkenntnisse. Die Behandlung mit GLP-1 über 10 Tage reduzierte das Körpergewicht und senkte die Nüchternglykämie. Über diese für eine Diabetestherapie günstigen Effekte verfügt das GIP nicht. Die histologische Untersuchung des Pankreas nach der 10-tägigen Behandlung mit GIP zeigte im Vergleich zu Kontrolltieren eine höhere Zahl Insulin produzierender Zellen im Pankreas. Die GIP Injektionen übten damit einen messbaren Effekt auf die Erhaltung bzw. Neubildung Insulin produzierender Zellen aus. Die Bolus Applikation von GIP und GLP-1 vor dem IVGTT induzierte bei den hyperglykämischen Tieren einen kurzen Insulinanstieg, der aber durch die anschließende Glukosegabe nicht mehr induzierbar war, die ß-Zellen waren scheinbar erschöpft. Die systemische DPP-4-Hemmung verstärkte in den diabetischen Tieren die durch GIP induzierte Insulinausschüttung und senkte die Blutglukose. Im Gegensatz dazu wurde der insulinogene Effekt von GLP-1 durch die DPP-4-Hemmung nicht verändert. Damit wurden die bei den gesunden Ratten erhobenen Befunde in den ZDF Ratten Versuchen reproduziert. Die vorgelegten Ergebnisse zeigen, dass das GIP eine Reihe wertvoller, die ß-Zellfunktion betreffenden Wirkungen besitzt. Die Arbeiten an GIP Analoga sollten weiter geführt werden, um das Potential des GIP bei der Therapie des Diabetes besser nutzen zu können.
Die Polyarteriitis nodosa ist eine seltene nekrotisierende Vaskulitis der mittelgroßen Arterien, die erstmalig Kussmaul und Maier 1866 beschrieben haben. Peters et al. konnten in ihrem Tiermodell die Polyarteriitis nodosa in Cyp1a1ren2 transgenen Ratten reproduzierbar induzieren. Notwendige Faktoren sind die proreninabhängige Aktivierung des Renin-Angiotensin-Systems und die Implantation eines telemetrischen Blutdrucksenders in die Aorta. Die orale Darbietung von I3C führt zur Aktivierung des Cyp1a1-Promoters und daraus resultierend zu einer dosisabhängigen Expression von Prorenin aus dem murinen ren2-Transgen. Die Implantation des telemetrischen Blutdrucksenders stimuliert das Immunsystem, was über den Nachweis von undefinierten Autoantikörpern sichtbar wird. Nur die Kombination all dieser Faktoren ist ausreichend, um eine PAN zu induzieren. Die Studie untersucht, ob die Polyarteriitis nodosa der Cyp1a1ren2 transgenen Ratte abhängig vom AT1-Rezeptor ist, ob sich ihr Verlauf beeinflussen lässt und ob die Vaskulitisschäden teilweise oder sogar ganz heilbar sind. Nach einer Krankheitsinduktionsphase von 6 Wochen erfolgte bei einem Teil der Ratten die Therapie mit dem AT1-Rezeptorblocker Losartan. Losartan konnte das Fortschreiten der PAN stoppen. Infolge der Therapie war bei keiner dieser Ratten histologisch eine aktive PAN mehr nachweisbar. Diese Studie liefert starke Hinweise darauf, dass Losartan eine bestehende PAN bei der Cyp1a1ren2 transgenen Ratte zur Abheilung bringt. Dies begleitet eine Reendothelialisierung. Residual findet sich häufig eine Fibrose. Die immunhistochemische Untersuchung der Organe zeigte, dass sich im Bereich der von aktiver PAN betroffenen Blutgefäße der nicht therapierten Gruppe eine vermehrte Anzahl an CD4-positiven Immunzellen insbesondere Makrophagen/Monozyten befinden; diese können pathognomonisch bedeutsam sein. Die vorliegende Arbeit liefert starke Hinweise darauf, dass die Polyarteriitis nodosa der Cyp1a1ren2 transgenen Ratte AT1-Rezeptor vermittelt ist und eine Losartantherapie zur Regression der Erkrankung führen kann.
Das Zusammenspiel von Transportproteinen in den Nieren, der Leber und im Intestinaltrakt ist notwendig für die effiziente Elimination von potentiell giftigen Metaboliten und die Erhaltung von essentiellen Metaboliten für den Organismus. Dabei spielen die Effluxmechanismen der Multidrug Resistance-related Proteine (Mrp) eine wichtige Rolle in der Absorption, Verteilung und Elimination von endogenen und xenobiotischen Substanzen. In den Epithelzellen des Nierentubulus sind Mrp2 (Abcc2) und Mrp4 (Abcc4) apikal exprimiert während sich Mrp3 (Abcc3) in der basolateralen Membran befindet. Die Rolle der Mrp-Transporter in der Regulation des zellulären Redoxstatus ist noch nicht aufgeklärt. Die systemische Mrp2-Defizienz induziert die mRNA-Expression antioxidativer Proteine in der Niere. Auch die Aktivität des sympathischen Nervensystems ist wichtig für die Nierenfunktion. Der Einfluss der renalen Innervation auf den Transport organischer Ionen ist bisher kaum untersucht. In der vorliegenden Arbeit sollte die Hypothese getestet werden, dass das sympathische Nervensystem einen Einfluss auf die Expression und Funktion der Mrp-Transporter hat. Zunächst sollte nach renaler Denervation von Lewisratten und kongenen Mrp2-defizienten Ratten die Transporterexpression und -funktion von Mrp2 und Mrp4 bestimmt werden. Weiterführend sollte als Modell für eine Nierenschädigung die 5/6-Nephrektomie nach drei bzw. sieben Wochen beschrieben und der Einfluss der renalen Denervation auf die Expression von Mrp2, Mrp3 und Mrp4 bestimmt werden. Ein anderer Schwerpunkt dieser Arbeit lag auf der Rolle von Mrp2 bei der zellulären Redoxregulation unter nephrotoxischen Bedingungen. Es wurde die Hypothese getestet, dass die renale Mrp2-Defizienz eine akute CsA-induzierte Nephrotoxizität verstärkt. Die kongene Transplantation von Mrp2-defizienten Nieren auf Wildtypempfänger (Lewisratten) erzeugte eine isolierte renale Mrp2-Defizienz. Als Kontrollen dienten syngene Transplantationen unter Lewisratten. Die Tiere wurden für eine Woche mit CsA in einer immunsuppressiv wirkenden Dosis bzw. einer zusätzlich nephrotoxisch wirkenden Dosis oder mit einer Placebodiät behandelt. Zur Überprüfung der Hypothesen wurde die Transporterfunktion durch Clearance-Messungen und die Transporterexpression durch Real-time PCR, Western blot und Immunhistologie untersucht. Darüber hinaus charakterisierte ein PCR-Array das nephrotoxisch-veränderte Expressionsmuster. Außerdem wurden Enzymaktivitäten durch Lucigenin-verstärkte Chemilumineszenz und fotometrische Enzymaktivitätsassays sowie die Glutathionkonzentration fotometrisch ermittelt. Die renale Denervation ohne Reduktion der Nierenmasse hatte keinen Einfluss auf die Transporterexpression und -funktion von Mrp2 und Mrp4 in der Niere. Die 5/6-Nephrektomie führte zu erhöhten Mrp2- und Mrp4-mRNA-Gehalten und zu einem reduzierten Mrp3-Proteingehalt im renalen Kortexgewebe. Durch zusätzliche renale Denervation bei 5/6-Nephrektomie war der mRNA-Gehalt von Mrp3 signifikant erhöht. Bei 5/6-Nephrektomie war nach drei Wochen ein erhöhter Glutathionquotient als Indikator für oxidativen Stress im Nierengewebe messbar, der durch die renale Denervation signifikant reduziert wurde. Sieben Wochen nach der Denervation bei 5/6-Nephrektomie war die Expression und Lokalisation der Mrp-Transporter nicht verändert. Des Weiteren war zu diesem Zeitpunkt der renale Gesamtglutathiongehalt unabhängig von der renalen Denervation reduziert. Nach sieben Wochen vermehrt auftretende Hydronephrosen im Nierenkortex lassen sich als ein histologisches Anzeichen für einen Nierenschaden deuten. Die durch CsA-Behandlung höheren mRNA-Gehalte der UDP-Glucuronosyltransferase 1a6 und der Glutathionperoxidase 2 waren im Falle einer nierenspezifischen Mrp2-Defizienz zusätzlich erhöht. Dieser Effekt und auch der durch Mrp2-Defizienz erhöhte mRNA-Gehalt des Cytochroms 1a1 weisen auf eine erhöhte metabolische und oxidative Belastung im Transplantatgewebe durch das Fehlen von Mrp2 bei CsA-induzierter Nephrotoxizität hin. Durch die Behandlung mit CsA trat dosisabhängig ein erhöhter Glutathionquotient im Transplantatgewebe auf. Die nierenspezifische Mrp2-Defizienz führte nicht zu einem signifikant erhöhten Glutathionquotienten. Eine mögliche funktionelle Redundanz anderer renaler Transporter wie Mdr1 könnte den Effekt der Mrp2-Defizienz limitieren. In dieser Arbeit konnte eine mit oxidativem Stress assoziierte Abhängigkeit des mRNA-Gehalts des basolateralen Transporters Mrp3 vom sympathischen Nervensystem unter Reduktion der Nierenmasse nachgewiesen werden. Außerdem verstärkt die renale Mrp2-Defizienz nicht die akute CsA-induzierte Nephrotoxizität, was möglicherweise auf eine kompensatorische Induktion der Glutathionperoxidase 2, der UDP-Glucuronosyl-transferase 1a6 oder des renalen Transporters Mdr1 zurückgeht.