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Staphylococcus aureussuperantigens (SAgs) are among the most potent T cell mitogensknown.They stimulate large fractions of T cells by cross-linking their T cell receptor withmajor histocompatibility complex class-II molecules on antigen presenting cells, resulting in Tcell proliferation and massive cytokine release. To date, 26 different SAgs have been described in thespeciesS. aureus; they comprise the toxic shock syndrome toxin (TSST-1), as well as 25 staphylococcalenterotoxins (SEs) or enterotoxin-like proteins (SEls). SAgs can cause staphylococcal food poisoningand toxic shock syndrome and contribute to the clinical symptoms of staphylococcal infection. Inaddition, there is growing evidence that SAgs are involved in allergic diseases. This review providesan overview on recent epidemiological data on the involvement ofS. aureusSAgs and anti-SAg-IgEin allergy, demonstrating that being sensitized to SEs—in contrast to inhalant allergens—is associatedwith a severe disease course in patients with chronic airway inflammation. The mechanisms by whichSAgs trigger or amplify allergic immune responses, however, are not yet fully understood. Here, wediscuss known and hypothetical pathways by which SAgs can drive an atopic disease
In Deutschland gibt es ca. 3 Millionen Kontaktlinsenträger und pro Jahr ca. 12000 kontaktlinsen-assoziierte Keratitiden. Die Hauptursache dieser Keratitiden ist die mangelnde Compliance der Kontaktlinsenträger hinsichtlich einer adäquaten Kontaktlinsenhygiene. Leider sind jedoch die gängigen Reinigungsmethoden, besonders die am häufigsten angewandte chemische Reinigung mit den so genannten All-in-One-Lösungen besonders anfällig für Hygienefehler (Austauschrhythmen, Einwirkzeiten, mechanische Vorreinigung).
In dieser Arbeit wurde nun ein neues Desinfektionsverfahren getestet, das weitestgehend unabhängig von der Compliance der Anwender ist. Dazu setzten wir UVC-Strahlung ein und bestrahlten damit weiche Monatslinsen. Wir verwendeten zwei unterschiedlich dimensionierte Prototypen (UVC-Bestrahlungsgerät, LED-UVC-Bestrahlungsgerät). Wir testeten das Verfahren anhand der Vorschriften der Europäischen Norm EN ISO 14729. Diese Norm regelt die mikrobiellen Anforderungen und Prüfverfahren für Produkte und Systeme zum Hygienemanagement von Kontaktlinsen. Sie verlangt zwei verschiedene Test. Der Stand Alone Test ist die Pflegemitteldirektprüfung. Dabei wird das neue Desinfektionsverfahren an einer Keimaufschwemmung getestet. Der Regimen Test ist die Prüfung des Verfahrens anhand der eigenen Pflegeanleitung. Das Verfahren muss dazu an 5 Testkeimen (Staphylococcus aureus, Serratia marcescens, Pseudomonas aeruginosa, Candida albicans, Fusarium solani) getestet werden.
Parallel zur UVC-Bestrahlung testeten wir noch vier handelsübliche All-in-One-Lösungen (Perfect Aqua Plus (MPG&E), Opti-Free Replenish (Alcon), All-in-One light (Sauflon Pharmaceuticals), Solo Care Aqua (Ciba Vision)) und verglichen dann die Ergebnisse.
Die Versuche bewiesen, dass die UVC-Bestrahlung sehr gut geeignet ist, um weiche Kontaktlinsen zu desinfizieren. Es reichten nur 30 s (UVC-Bestrahlungsgerät) bzw. 2 Stunden (LED-UVC-Bestrahlungsgerät) Bestrahlung aus um die geforderte Log-Reduktion von 3-5 Logstufen bei allen 5 Testorganismen zu erreichen.
Leider mussten wir feststellen, dass die All-in-One-Lösungen deutlich schlechter abschnitten und die Norm somit zum größten Teil nicht erfüllten, wenn man auf den Schritt der manuellen Vorreinigung verzichtete.
Zusammenfassend ist also zu sagen, dass die UVC-Bestrahlung eine sehr gute Alternative für die mikrobielle Reinigung von Kontaktlinsen, im Vergleich zu den herkömmlichen Verfahren, darstellt und dass ihre Wirksamkeit dabei weitestgehend unabhängig von der Compliance der Anwender ist.
Das Gram-positive Bakterium Staphylococcus aureus besiedelt die menschliche Haut und die oberen Atemwege, z.B. die Nase. Aus noch unbekannten Gründen können die Bakterien gelegentlich einen pathogenen Charakter entwickeln und Krankheiten wie Furunkulose, Pneumonien oder Sepsis verursachen. Dieses pathogene Potenzial in Verbindung mit dem Auftreten von zahlreichen Antibiotika-Resistenzen in vielen klinisch relevanten S. aureus-Stämmen stellt ein Risiko für die menschliche Gesundheit dar. Deshalb ist es notwendig, potenzielle Effekte der bakteriellen Produkte, die die eukaryotischen Wirtszellen relevanter Organsysteme beeinflussen könnten, zu erforschen. Ziel dieser Arbeit war es deshalb, spezifische Elemente der frühen Signaltransduktion, der Genregulation und der physiologischen Antworten von humanen immortalisierten Atemwegsepithelzellen (S9) auf Kontakt mit Staphylococcus aureus-Zellkulturüberständen sowie rekombinant hergestellten individuellen Virulenzfaktoren (Hämolysin A (Hla, ein porenformendes Toxin) und Hämolysin B (Hlb, ein Enzym mit Sphingomyelinase-Aktivität)) zu untersuchen. Diese Ansätze dienen dazu, Hinweise auf die Identität sezernierter Stoffwechselprodukte von S. aureus zu erhalten, die in den eukaryotischen Wirtszellen zu direkten Abwehr- oder Vermeidungsreaktionen (angeborene Immunität) oder zu Bakterien-induziertem „Fehlverhalten“ führen, das möglicherweise (Mit-)Ursache der Pathogenität einiger Stämme des Bakteriums ist. Quantitative Western-Blot-Analysen mit löslichen Proteinextrakten von S9-Zellen offenbarten dabei eine Aktivierung der Erk-Typ-MAPK, der p38 MAPK und der Akt1/3, aber keine Aktivierung der c-Jun N-terminalen Kinase (JNK) oder Akt2 infolge der Behandlung mit steril-filtrierten S. aureus-Überständen aus der exponentiellen Wachstumsphase (OD540nm = 1), der stationären Wachstumsphase (OD540nm = 10) bzw. nach der Behandlung mit rekombinant hergestellten S. aureus Hämolysinen (rHla, rHlb). Analysen der Produkte sogenannter „früher Gene“ zeigten eine moderate Erhöhung der Expression von c-Jun und Egr-1, und eine stärkere Erhöhung der Expression von c-Fos nach der Behandlung der S9-Zellen mit den bakteriellen Überständen oder rekombinanten Toxinen (rHla, rHlb). Da Atemwegsepithelzellen bei Kontakt mit potenziell pathogenen Bakterien bzw. sekretorischen Faktoren dieser Bakterien Chemokine zur Rekrutierung von Neutrophilen sekretieren, (speziell IL-8), wurde ein Multiplex-Assay-System eingesetzt, mit dem es möglich war, 11 verschiedene Zytokine im Kulturüberstand der S9-Zellen nach Behandlung der Zellen mit den bakteriellen OD10-Überständen bzw. rekombinanten Hla oder Hlb zu analysieren. Die S9-Zellen reagierten dabei auf die Behandlung mit dem Überstand, Hla oder Hlb mit der Sekretion der pro-inflammatorischen Zytokine IL-8, IFN-γ und IL-6, und diese Zytokin-Expression wurde teilweise vermittelt über die Signalwege der Erk-Typ-MAPK und der p38 MAPK. Weiter konnte gezeigt werden, dass Atemwegsepithelzellen infolge der Behandlung mit bakteriellem Überstand bzw. Hla Zellformveränderungen unterliegen und ihre Integrität verlieren. Dieses könnte parazelluläre Wege im Epithel öffnen, und so den Bakterien ermöglichen, ins Innere des Wirtskörpers vorzudringen.
Streptococcus pneumoniae (pneumococci) and Staphylococcus aureus (S. aureus) are human-specific commensals of the upper respiratory tract. Every individual is asymptomatically colonized with both bacteria at least once in their life-time. The opportunistic pathogens can affect further organs and invade into deeper tissue. The occupation of normally sterile niches of the human body with the bacteria can lead to local infections such as sinusitis, otitis media and abscesses, or to life-threatening diseases like pneumonia, meningitis or sepsis. A strong interaction between the bacterium and the respiratory epithelial cells is a prerequisite for a successful colonization. This interaction is ensured by bacterial surface proteins, so called adhesins. The binding of the adhesins to the epithelial lineage occurs predominantly indirectly via components of the extracellular matrix (ECM), but also directly to cellular receptors. Pneumococci and S. aureus bind to various ECM glycoproteins, amongst others: fibronectin, fibrinogen, vitronectin, and collagen. Also binding of both pathogens to human thrombospondin-1 has been described. Thrombospondin-1 is mainly stored in the α-granula of thrombocytes (platelets) and released into the circulation upon activation. However, thrombospondin-1 is also produced and secreted by other cell types like endothelial cells, macrophages, and fibroblasts, which gets subsequently incorporated as component into the ECM. So far, no thrombosponin-1-binding adhesins of pneumococci were identified. PspC, Hic, and PavB are important surface-localized virulence factors, which were shown to interact with human ECM and plasma proteins. PspC and Hic bind to vitronectin and factor H, which inhibits the complement cascade of the human immune system. PavB interacts with fibronectin and plasminogen, and a pavB-deficient mutant of S. pneumoniae showed diminished capacity in colonization in a mouse model. Among the surface proteins of S. aureus, only Eap was identified as thrombospondin-1-binding adhesin. Beyond colonization, pneumococci and S. aureus can enter the blood circulation, interact with platelets, and cause their activation. The aggregation of platelets, especially initiated by S. aureus, plays an important role in the clinic, because most of the septic patients develop thrombocytopenia. Surface localized factors of
S. pneumoniae triggering platelet activation are unknown to date. In contrast, few proteins of S. aureus with potential to activate platelets, including Eap, were identified previously.
This study identified the surface proteins PavB, PspC, and Hic of S. pneumoniae as specific ligands of the human thrombospondin-1. Flow cytometric, surface plasmon resonance spectroscopic and immunological analyses revealed interactions between the pneumococcal proteins and soluble as well as immobilized thrombospondin-1. The use of specific pneumococcal deletion mutants verified the importance of the three virulence factors as binding partners of soluble thrombospondin-1. The results suggest that pneumococci are capable of acquiring soluble thrombospondin-1 from blood as well as utilizing immobilized glycoprotein of the ECM as substrate for adhesion. Furthermore, the thrombospondin-1-binding domain within the pneumococcal proteins was analyzed by use of recombinant fragments of PavB, PspC, and Hic. The binding capacity of thrombospondin-1 increased proportionally with the amount of repetitive sequences in PavB and PspC, and the length of the α-helical region within the Hic molecule. The binding behavior of thrombospondin-1 towards PavB and PspC is comparable with that of the ECM proteins vitronectin and fibronectin, but is unique towards Hic.
The localization of the binding domain of the adhesins within the thrompospondin-1 molecule occurred via use of glycosaminoglycans as competitive inhibitors for the interaction. The results suggest that the pneumococcal proteins Hic and PspC target the identical binding region within thrombospondin-1, which differs from the binding domain for PavB. However, all three virulence factors seem to bind in the N-terminal part of thrombospondin-1.
Two-dimensional gel electrophoresis, thrombospondin-1 overlay assay and subsequent mass spectrometric analysis identified AtlA of S. aureus as a surface localized interaction partner of human thrombospondin-1. Moreover, a vitronectin binding activity for AtlA was determined. Immunological and surface plasmon resonance binding studies with recombinant AtlA fragments revealed that interactions with both matrix proteins is mediated via the C-terminal located repeats R1R2 of the AtlA amidase domain. Binding of thrombospondin-1 and vitronectin occurred not simultaneously, due to a competitive inhibition.
The second part of the study focused on the activation of human platelets by recombinant pneumococcal and staphylococcal proteins. In total, 28 proteins of S. pneumoniae and 52 proteins of S. aureus were incubated with human platelets. The activation of the cells was detected by flow cytometry using the activation markers P-selectin and the dimerization of the integrin αIIbβIII. The proteins CbpL, PsaA, PavA, and SP_0899 of S. pneumoniae induced platelet activation, however, the detailed mechanism has to be deciphered in further studies. Furthermore, the secreted proteins CHIPS, FLIPr, and AtlA of S. aureus were discovered as inductors for the activation of platelets. In addition, the domains of AtlA and Eap, crucial for platelet activation, were narrowed down. Interestingly, CHIPS, FLIPr, and Eap were described as inhibitors of neutrophil recruitment. Platelets are recently recognized as immune cells, due to the expression of immune receptors. The data obtained in this study highlight a comprehensive spectrum of effects of the S. aureus proteins towards different type of immune cells. Besides the activation of platelets in suspension buffer and plasma, the aggregation of platelets in whole blood was triggered by the proteins CHIPS, AtlA, and Eap. These results suggest a contribution of the proteins during the S. aureus-induced infectious endocarditis. Secretion of the platelet activating virulence factors, which were identified within this study, might represent a pathogenic strategy during S. aureus infection in which a direct contact between S. aureus and platelets is not required or even avoided.
In conclusion, PavB, PspC, and Hic of S. pneumoniae and AtlA of S. aureus were identified as interaction partners of human thrombospondin-1. Furthermore, CHIPS, FLIPr, AtlA, and Eap were characterized as platelet activators. This study provides candidates for the development of protein-based vaccines, to prevent bacterial colonization and to neutralize secreted pathogenic factors.
Ziel der Dissertation war die Untersuchung der physiologischen Adaptation von Staphylococcus aureus an Vancomycin und Linezolid mit Hilfe der Proteom-Analytik und die Entwicklung neuer Methoden für Proteom-Untersuchungen. Für die Untersuchung der Vancomycinstress-Antwort im ersten Teil der Doktorarbeit wurden alle vier Subproteome mit insgesamt sechs verschiedenen Methoden untersucht. Es konnte mehr als die Hälfte des theoretischen Proteoms quantifiziert werden, die Arbeit ist damit eine der umfassendsten Proteom-Studien, die bisher in S. aureus durchgeführt wurden. Es wurden verschiedene Enzyme der Biosynthese von Aminosäuren, die im Peptidoglykan-Vorläufer-Pentapeptid vorkommen, nach Vancomycin-Stress in signifikant erhöhter Menge nachgewiesen. Das ist ein Hinweis auf eine erhöhte Peptidoglykan-Synthese, wie sie auch in S. aureus Stämmen mit verminderter Vancomycin-Sensitivität beobachtet werden kann. Die Abundanz SaeRS-kontrollierter Virulenzfaktoren war nach Vancomycin-Stress vermindert. In der Vancomycin-Studie wurden extrazelluläre Proteine mit einer Trichloressigsäure (TCE)-Fällung gefällt, diese Methode ist in der Proteom-Analytik weit verbreitet. Die TCE-Fällung hat verschiedene Nachteile. Nach der Fällung muss das entstandene Pellet mehrfach gewaschen werden, hierbei kommt es zu Verlusten und die Reproduzierbarkeit sinkt. Aufgrund dieser Nachteile wurde im zweiten Teil der Dissertation ein neues Protokoll zur Anreicherung verdünnter Proteine entwickelt. Grundlage war das kommerziell erhältliche Festphasenextraktions-System StrataClean, das ursprünglich zur Entfernung von Proteinen aus PCR-Ansätzen entwickelt wurde. Im Rahmen der Doktorarbeit wurde die StrataClean-Extraktion für die gel-freie Proteom-Analytik optimiert. Der wichtigste Schritt war eine Präinkubation der StrataClean-Partikel in Salzsäure, um Kontaminationen an den Partikeln quantitativ abzubauen. Mit dem optimierten Protokoll konnten Proteine auch aus sehr stark verdünnten Lösungen (20 µg Protein in 200 ml Flüssigkeit) mit hoher Effizienz reproduzierbar angereichert werden. Diese hoch-effiziente Anreicherung ist mit keinem anderen etablierten Protokoll möglich. Zudem konnte gezeigt werden, dass die StrataClean Fällung Proteine unabhängig von ihren biophysikalischen Eigenschaften anreichert. Daher ist die StrataClean-Aufreinigung auch für absolute Quantifizierungsansätze interessant. Als weitere Anwendung können StrataClean-gebundene Proteine für mehr als 10 Tage bei Raumtemperatur gelagert werden. Das ermöglicht den Versand von Proteinproben auf dem normalen Postweg ohne aufwendige Kühlsysteme. Im dritten Teil der Doktorarbeit wurde die Linezolid-Adaptation von S. aureus USA300 analysiert. In Wachstumsversuchen konnte gezeigt werden, dass nach Linezolid-Zugabe zu exponentiell wachsenden Zellen bei OD 0.5 die Wachstumsrate sofort abnahm. Bei OD 1.6 – 2 trat ein temporärer Wachstumsarrest auf, dessen Dauer von der zugegebenen Linezolid-Konzentration abhing. Nach diesem Wachstumsarrest, der bis zu 15 Stunden anhielt, fingen die Zellen wieder an sich zu teilen. Es konnte gezeigt werden, dass die Linezolid-Konzentration im Medium während des kompletten Versuches konstant blieb. Die Hauptanpassung an Linezolid war eine verstärkte Expression der Gene ribosomaler Proteine und eine daraus folgende erhöhte Akkumulation der ribosomalen Proteine. Zudem konnte eine generelle Abnahme der Menge integraler Membranproteine und sekretierter Proteine festgestellt werden, auch wenn die Expression der codierenden Gene zunahm. Mittels elektronenmikroskopischer Analysen konnte gezeigt werden, dass die Zellen nach Linezolid-Zugabe deutlich größer wurden. Als weitere morphologische Auswirkung von Linezolid-Stress war die Dicke der Zellwand um den Faktor vier erhöht und es wurden Defekte in der Zellteilung beobachtet. Insbesondere nach Wiederaufnahme des Wachstums gab es zahlreiche zelluläre Strukturen, die mehrere, zum Teil falsch positionierte, Septen hatten. Mit Fluoreszenz-Mikroskopie wurde bewiesen, dass sich das Chromosom, das im normalen Wachstum das Cytosol ausfüllt, nach Linezolid-Zugabe komprimierte und den Kontakt zur Membran verlor. Eine Verbindung zwischen Chromosom und Membran wird durch Transertions-Komplexe gebildet. Transertion bezeichnet die simultane Transkription, Translation und Translokation integraler Membranproteine, dabei werden Komplexe aus Chromosom, mRNA, Ribosom, dem entstehendem Protein und den membranständigen SEC-Proteintransportern gebildet. Aus der Kombination der Ergebnisse wurde geschlossen, dass durch die Linezolid ausgelöste Translations-Hemmung die Transertionskomplexe aufgelöst werden und dadurch die Protein-Translokation vermindert wird. Auch die Defekte in der Zellteilung können so erklärt werden, da so das Chromosom eine Struktur-gebende Funktion für die Zellteilung verliert. Bisher war nicht vollständig bekannt, wie die strukturelle Ordnung in der Zellteilung von Staphylokokken entsteht.
This thesis contains results from transcriptome studies on different aspects of host-pathogen interactions. First, liver gene expression profiles from a murine chronic stress model served to elucidate aspects of the influence of stress on metabolism and immune response state. Chronic stress in female BALB/c mice was shown to lead to a hypermetabolic syndrome including induction of gluconeogenesis, hypercholesteremia, and loss of essential amino acids, to the induction of the acute phase response, but also of immune suppressive pathways and to the repression of hepatic antigen presentation. Increased leukocyte trafficking, increased oxidative stress together with counter-regulatory gene expression changes, and an induction of apoptosis were detected. The influence of intra-venous infection on the host kidney gene expression was analyzed in another murine model using the wild type strain Staphylococcus aureus RN1HG and its isogenic sigB mutant. Gene expression profiling indicated a highly reproducible host kidney response to infection. The comparison of infected with non-infected samples revealed a strong inflammatory reaction of kidney tissue, e. g. Toll-like receptor signaling, complement system, antigen presentation, interferon and IL-6 signaling. However, the results of this study did not provide any hints for differences in the pathomechanism of the S. aureus strains RN1HG and ΔsigB, since the host response did not differ between infections with the two strains analyzed. Effects of SigB might be transient, only apparent at earlier time points, or might also be compensated for in the in vivo infection by the interlaced pattern of other regulators. SigB might possess only to a lesser extent characteristics attributed to virulence factors and might act in vivo more like a virulence modulator and fine tune bacterial reactions. In addition to the analysis of tissue samples, different in vitro models were furthermore studied. The third part of this thesis focuses on bone-marrow derived macrophages (BMM) of the two mouse strains BALB/c and C57BL/6, which are described in literature to exhibit genetically determined differences in their reaction to infection. Expression profiling was performed on control and IFN-γ treated samples from a serum-free cultivation system and revealed mainly induction of gene expression after treatment of BMM with IFN-γ. Gene expression changes confirmed known IFN-γ effects like induction of immunoproteasome, antigen presentation, interferon signaling related genes, GTPase/GBPs, and inducible NO synthase. IFN-γ dependent gene expression changes were highly similar in BALB/c and C57BL/6 BMM. Considering gene expression differences between BMM of both strains, a similar expression trend was visible on the level of untreated controls as well as after IFN-γ treatment. Differentially expressed genes between BMM of both strains included immune-relevant genes as well as genes linked to cell death, but the coverage of functional groups was limited. The bronchial epithelial cell line S9 was used as an in vitro model system for the infection with S. aureus RN1HG. The fourth chapter in this thesis includes S9 cell gene expression signatures 2.5 h and 6.5 h after start of infection. At the early time point, only 40 genes were differentially expressed, which nevertheless indicated a beginning pro-inflammatory response, e. g. induction of cytokines (IL-6, IFN-β, LIF) or prostaglandin-endoperoxide synthase 2 (PTGS2), but also counter-regulatory processes, e. g. induction of CD274. The host cell response was dramatically aggravated at the later 6.5 h time point. Differential expression was detected for 1196 genes. These included induced cytokines, pattern recognition receptor signaling, antigen presentation, and genes involved in immune defense (e. g. GBPs, MX, APOL). Negative effects on growth and proliferation were even more enhanced in comparison to the early time point, and signs for apoptotic processes were revealed. Finally, the last chapter addresses amongst others the pathogen’s expression profile in the S9 cell in vitro infection model at the two time points 2.5 h and 6.5 h after start of infection by tiling array gene expression analysis. The pathogen expression profiling revealed the activity of the SaeRS two-component system in internalized staphylococci. Partly dependent on SaeRS, the induction of adhesins (e. g. fnbAB, clfAB), toxins (hlgBC, lukDE, hla), and immune evasion genes (e. g. chp, eap) was observed. Furthermore, expression changes of metabolic genes were recorded (gene induction of amino acid biosynthesis, TCA cycle, gluconeogenesis; gene repression of glycolysis, purine biosynthesis, tRNA synthetases). Expression analysis recorded a distinct bacterial expression program, which supported literature results of a specific, bacterial strain and host cell line dependent transcriptional adaptation of the pathogen.
Staphylococcus (S.) aureus nimmt dem Menschen gegenüber eine ambivalente Rolle ein, da er zum einen häufiger Kommensale ist, aber auch zum Pathogen werden kann. Zu den bedeutendsten Gegnern von S. aureus zählen die neutrophilen Granulozyten. Sie haben eine kurze Lebensspanne und weisen hochspezialisierte Zelltodstrategien, wie Apoptose oder NETose auf. Auffälligerweise besitzen S. aureus-Isolate, die Furunkulose auslösen, überproportional häufig das Gen für das Panton-Valentine-Leukozidin (PVL), welches hochspezifisch humane neutrophile Granulozyten lysiert. Zu den Interaktionen zwischen S. aureus und Neutrophilen sind noch viele Fragen ungeklärt. Die Ziele dieser Arbeit waren deshalb (1) die Charakterisierung der Wirkung von S. aureus auf das Zelltodverhalten von Neutrophilen und (2) der Vergleich dieser Mechanismen bei kommensalen S. aureus-Isolaten und Isolaten von Patienten mit chronisch rekurrenter Furunkulose. Dazu wurde der Zelltod von Neutrophilen mit einem DNA-Freisetzungstest (Sytox-Assay) und mittels Immunfluoreszenzfärbung analysiert. Auffällig waren dabei folgende Beobachtungen: (1) Hohe Konzentrationen der S. aureus-Kulturüberstände führten zur Nekrose der Neutrophilen. In sublytischen Konzentrationen bewirkten Überstände der stationären Wachstumsphase dagegen eine Verzögerung der natürlichen Apoptose der Neutrophilen in Kultur, deren Fähigkeit zur proinflammatorischen Aktivierung dabei erhalten blieb. Es ist vorstellbar, dass sich S. aureus, von dem inzwischen bekannt wurde, dass er auch intrazellulär persistieren kann, auf diese Weise in den Neutrophilen eine Überlebensnische schafft. Bei Stimulation mit lebenden Bakterienzellen konnten konzentrationsabhängig Nekrose, Apoptose und geringfügig NETose der Neutrophilen beobachtet werden. (2) Der Vergleich von S. aureus-Isolaten aus nasaler Besiedlung und Furunkuloseinfektion zeigte, dass bakterielle Überstände von Furunkulose-Isolaten, die die PVL-kodierenden Gene besaßen, eine deutlich stärkere Lyse der Neutrophilen verursachten. Dieser Effekt war nur dann zu beobachten, wenn die Bakterien tatsächlich PVL bildeten, wozu sie nur in besonders reichhaltigen Medien in der Lage waren. Dies ist ein starker Hinweis darauf, dass der Zelltod durch PVL verursacht wurde. Mit lebenden Bakterien konnten zwischen beiden Gruppen keine Unterschiede in der Zelltodinduktion der Neutrophilen festgestellt werden. Die Ergebnisse dieser Arbeit zeigen, dass S. aureus neutrophile Granulozyten auf verschiedene Weise beeinflussen kann: Neben der Induktion von Zelltod können die Bakterien auch Substanzen freisetzen, die die Lebensspanne der Abwehrzellen verlängern. Außerdem stützen die Befunde das Konzept einer zentralen Rolle für PVL bei Haut- und Weichteilinfektionen durch S. aureus, das bisher vor allem auf epidemiologischen Befunden basierte.
The metabolomic approach is one part of the "-omics" cascade further comprising genomic, transcriptomic, and proteomic investigations. Since information about the metabolome of the important human pathogenic bacterium Staphylococcus aureus is scarce, the aim of this thesis is the characterization of the exo- and endometabolome of this bacterium on a most global scale. For this, the metabolomic platform consisting of the analytical instruments used for 1H-NMR spectroscopy, HPLC-MS, and GC-MS analysis was applied. First, the requirements for an accurate sampling procedure for the analysis of intracellular metabolites are presented, explaining important pitfalls during the sampling and the subsequent metabolome analysis via HPLC-MS and GC-MS (book chapter I). The challenging task of the metabolite identification is demonstrated, as well as the requirements for absolute quantification of intracellular metabolites. In order to enhance the knowledge about the staphylococcal physiology and the biochemical network, the impact of different stresses and varying cultivation media on the bacterial metabolite pool was investigated in several studies. In article I, a first description of the primary metabolism of growing S. aureus COL cells cultivated aerobically in CDM is provided. This study also monitored the adaptation to glucose starvation on the level of metabolites and proteins. The uptake of all amino acids and the secretion and reuse of overflow metabolites were analyzed in a time-dependent manner. During the switch to a non-growing state, a drastic rearrangement of the amino acid pool in the bacterial cells was detected, and intracellular amounts of glycolytic intermediates were found to decrease in parallel to extracellular glucose exhaustion. During infection processes, S. aureus has to cope with varying levels of oxygen supply, including anaerobic conditions. A global metabolomic approach investigated the adaptation of S. aureus COL to strict anaerobic conditions using CDM as the culture medium. Thereby only linear growth was possible despite the higher uptake rate of glucose compared to aerobically, logarithmically growing cells. In an anoxic environment, S. aureus mainly switched on the less reliable lactic acid fermentation. Only serine and threonine but no alanine were significantly taken up. Subsequent glucose limitation led to energy starvation indicated by a drop in the adenylate energy charge. This was accompanied with an arrest of the fermentative metabolism and declining numbers of colony-forming units without taking advantage of the energy supplying arginine deiminase pathway. Compared to the established CDM, the eukaryotic cell culture medium RPMI 1640 provides more in vivo-like growth conditions. In article II, the growth behavior and the metabolic footprint of the S. aureus strains COL and HG001 were investigated during the aerobic cultivation in RPMI 1640 medium. Both strains are commonly used in laboratory research. The observed uptake and secretion pattern of extracellular metabolites provides important information for infection studies in which this medium is used for the precultivation of S. aureus. The extracellular accumulation of the noncanonical D-amino acid D-isoleucine was an interesting outcome. The strain specific metabolic footprint points to noteworthy differences in the biochemical system of both strains. Moreover, this study demonstrates the impact of the cultivation medium on the metabolic status of bacterial cells. Due to increasing resistance against a large number of antibiotics, community- and hospital- acquired infections with S. aureus are of major concern in medical therapy. Thus, greater knowledge about adaptive mechanisms after antibiotic treatment is required. In article III, the response of S. aureus HG001 to antibiotics with varying target sides, such as ciprofloxacin, erythromycin, fosfomycin, vancomycin, and ampicillin, was investigated on the metabolite level. Thereby, the abundances of 176 intracellular metabolites were observed in a time-dependent manner, thus providing the most comprehensive experimental metabolite dataset so far available for S. aureus. None of the antibiotic compounds led to alterations of single metabolite amounts, but mostly entire metabolic pathways were affected. The intermediates of the cell wall biosynthesis were affected by each antibiotic, confirming this pathway as the most potential target for new antibacterial compounds. The metabolite composition of human nasal secretions and human sweat was analyzed, since such secretions present natural habitats of S. aureus during the colonization of typical host sides. The results confirm that the bacteria has to cope with low concentrations of most of the amino acids but large amounts of urea and lactate during host colonization. Considering the supply of amino acids, the results support the usage of the RPMI 1640 medium as a step to more in vivo-like cultivation experiments. Moreover, essential information for future studies about the adaptation of S. aureus to more in vivo growth conditions is provided. Altogether, the metabolomic approach was proven to be an important tool for helping unravel the complex bacterial metabolism and the environmental factors that also play a role in the virulence of Staphylococcus aureus.
Staphylococcus aureus, einer der häufigsten Erreger von Pneumonien, Endokardien und Sepsen (Frank et al. 2010), gehört bei nahezu einem Drittel der Bevölkerung zur normalen Nasenschleimhautflora (van Belkum et al. 2009) und kann unter bestimmten Risikobedingungen, vor allem in nosokomialer Umgebung, weiter in die unteren Atemwege vordringen und sich dort vermehren (van Belkum et al. 2009, Ahmed et al. 2015). Da das respiratorische Epithel von einer dicken, viskösen Mukusschicht bedeckt ist (Knowles & Boucher 2002), die Bakterien aufgrund ihrer Größe kaum durchdringen können, liegt die Hypothese nahe, dass es die sehr viel kleineren, löslichen Virulenzfaktoren der Bakterien sind, die den Mukus überqueren und einen ersten Pathogen-Wirt-Kontakt herstellen können. Das lösliche, porenbildende α-Hämolysin (Hämolysin a, Hla) ist einer der Haupt-Virulenzfaktor von S. aureus (Spaulding 2012). Studien hatten gezeigt, dass Hla auch in sublytischer Konzentration zu einer Auflösung der Zell-Zell- (Inoshima et al 2012) und Zell-Matrix-Kontakte (Hermann et al. 2015) humaner Atemwegsepithelzellen führte und so eine Lückenbildung im Zellverband induzierte. In vivo könnten solche Hla-vermittelten Prozesse dazu beitragen, dass eine erste Schädigung des Epithels erfolgt und die Überwindung der epithelialen Barriere für S. aures erleichtert wird. Die vorliegende Arbeit konnte in einem ersten Teil zeigen, dass diese Unfähigkeit von humanen Atemwegsepithelzellen (16HBE14o- und S9), nach Inkubation mit rHla den epithelialen Zusammenhalt aufrecht zu erhalten und entstandene parazelluläre Lücken durch aktive Migration zu schließen, auf eine rHla-induzierte Hyperphosphorylierung des fokalen Kontaktproteins Paxillin an Tyrosin 118 (und damit erhöhten Turnover der fokalen Kontakte) und Hypophosphorylierung des Actin-depolymerisierenden Faktors Cofilin an Serin 3 (und damit verstärkten Abbau von Stressfasern) zurückzuführen war. Der Hla-Effekt konnte so in fünf Prüfgrößen quantifizierbar erfasst werden: (1) Verlust des epithelialen Zusammenhalts, (2) Reorganisation des Actinzytoskeletts, (3) Auflösung fokaler Kontakte, (4) Hyperphosphorylierung von Paxillin und (5) Hypophosphorylierung von Cofilin. Im zweiten Teil der Arbeit wurden diese Prüfgrößen herangezogen, um den Mechanismus der Hla-Wirkung genauer aufzuklären. Durch Einsatz einer nichtporenbildenden Mutante rHla-H35L und dem Porenblocker IB201 konnte zunächst gezeigt werden, dass für die schädigenden Effekte auf den epithelialen Zusammenhalt der Zellen Ausbildung einer funktionellen Hla-Pore notwendig war und nicht Bindungsereignisse der Monomere, der Vorpore oder der Pore allein den Hla-Effekt auslösen konnten. Um die porenabhängigen Ereignisse zu untersuchen, wurden Ionenströme durch die Hla-Pore identifiziert und mit Ionomycin (erzeugt einen Calciumeinstrom) und Gramicidin (erzeugt einen Natriumeinstrom und Membrandepolarisierung) nachgebildet. Beide Ionenströme zusammen konnten den Hla-Effekt nahezu vollständig erzeugen. Die Ergebnisse wiesen darüber hinaus darauf hin, dass die Hla-erzeugten ionalen Veränderungen an der Membran unterschiedliche Signalveränderungen in der Zelle vermittelten: Calciumaktivierte Signalwege schienen vor allem für die beobachtete Paxillin-Phosphorylierung verantwortlich zu sein, während ein Natriumeinstrom zu einer Cofilin-Dephosphorylierung führte. Die genaue Signaltransduktion zwischen Einstrom der Ionen und (De-)Phosphorylierungsereignissen erfordert jedoch noch eine genauere Aufklärung. Des Weiteren konnte die Modellierung der Ionenströme den Hla-Effekt nicht komplett nachbilden, sodass wahrscheinlich zusätzliche porenabhängige Signalwege nach Hla-Behandlung (z.B. Verlust von ATP, Baaske & Richter et al. 2016) aktiviert werden.
Functional characterization of a novel protease isolated from a mouse-adapted S. aureus strain
(2018)
Background: The high incidence of methicillin-resistant Staphylococcus aureus
(MRSA) strengthens the need for new effective antibiotics and a protective vaccine. Up till now, mainly human-adapted Staphylococcus aureus strains were used to study S. aureus pathogenicity in mouse models. However, it is known that S. aureus is highly host-specific. Recently, a mouse-adapted S. aureus strain, JSNZ, was identified. This strain could be a promising tool in developing more appropriate infection models. JSNZ produces high amounts of a putative extracellular protease, named JSNZ extracellular protease (Jep). Since the jep gene was only detected in S. aureus isolates from laboratory mice and wild small rodents and shrews, we hypothesize that Jep is important for colonization and infection in mice. The jep deletion mutant previously created by our collaborators from the University of Auckland, New Zealand, intriguingly showed a reduced survival and growth fitness in murine serum and whole blood as compared to the JSNZ wild type (WT) strain.
Objective: To elucidate the role of Jep in the interaction between S. aureus and its
host by comparing the impact of JSNZ WT with a mutant and a complement strain on the murine immune system. In addition, the elucidation of possible genetic factors behind host-adaptation of S. aureus strains isolated from wild rodents and shrews.
Methods: A jep complemented strain was generated by chromosomal replacement.
JSNZ WT, the jep mutant and the complement strain were subjected to functional
assays (whole blood survival assay, coagulation assay). In addition, the genetic
background that might confer host specificity was tested by staph array genotyping.
Results: The mutant strain JSNZDjep was successfully complemented with the jep
gene using a chromosomal integration approach. The WT strain and the
complemented strain produced the Jep protein in comparable amounts.
Unexpectedly, the complemented strains did not behave like the WT strain but rather like the mutant in a series of in vitro assays. Firstly, the growth of both the deletion mutant and the complemented strains was slightly reduced in TSB as compared to the WT strain. Secondly, the jep knockout strain showed a strongly reduced survival in murine whole blood compared to its wild type counterpart, but so did the complemented strain. Finally, the coagulation of murine plasma was less pronounced for the jep deletion mutant and the complemented strain as compared to the JSNZ WT. To exclude a defect in jep gene expression, we compared the amount of Jep expressed during growth in TSB medium for the three strains. The complemented strain produced Jep in a manner similar to the WT strain in a growth-phase dependent manner, suggesting that Jep expression was not affected during the creation of the complemented strain.
The array data showed some differences in the genetic makeup between animal
isolated strains and matched human strains. For example, while all animal isolates of the CC88 lacked the resistance mecA gene it was found in some human isolates of the same strain.
Conclusion: In conclusion, our unidentified mutation created during the generation
of the jep knock-out strain rather than the jep gene itself manipulated the murine
immune response. The responsible gene and the underlying mechanisms remain to
be clarified. Genetic profiling of S. aureus strains allowed us to obtain some valuable information including data about CC49, the most frequently isolated lineage in wild rodents and shrews where compared to the human isolates the murine strains showed clear signs of host adaptation. However, the analysis had several limitations including the small sample size.
Auf den inneren und äußeren Oberflächen des Menschen existieren zahlreiche Mikrohabitate mit limitiertem Sauerstoffangebot. Vor allem während infektiöser Vorgänge kann aufgrund einwandernder Neutrophile die Sauerstoffkonzentration im menschlichen Gewebe auf unter 1% sinken. Eine rasche Anpassung an das vorherrschende Sauerstofflevel und die Nutzung effizienter alternativer Atmungsformen oder des Gärungsstoffwechsels sind deshalb entscheidend für das mikrobielle Überleben im menschlichen Wirt. In der vorliegenden Dissertationsarbeit wurde die anaerobe Genexpression von Staphylococcus aureus sowie die zugrundeliegenden regulatorischen Mechanismen näher untersucht. Die sich in vier Teile gliedernde Arbeit befasst sich zunächst mit einer eingehenden Beschreibung der anaeroben Adaptation und Physiologie von S. aureus auf Ebene des Transkriptoms, der Proteinsynthese und des extrazellulären Metaboloms. Die Identifikation eines konservierten Sequenzmotivs (inverted repeat) vor zahlreichen anaerob induzierten Genen war Ausgangspunkt für die Untersuchung der entsprechenden regulatorischen Vorgänge im zweiten Teil dieser Arbeit. Diese führten letztlich in Kooperation mit Arbeitsgruppen aus den USA, Schweden und Deutschland (AG R. Proctor, Universität Wisconsin; AG C. von Wachenfeldt, Universität Lund; AG C. von Eiff, Universität Münster; AG M. Lalk, Universität Greifswald) zu der Identifikation des Rex Proteins (SACOL2035) als zentraler Regulator der anaeroben Genexpression in S. aureus. Neben der Rex-abhängigen Expressionskontrolle wurde in Kooperation mit der Arbeitsgruppe von Friedrich Götz (Universität Tübingen) auch der Einfluss des Zwei-Komponenten¬systems NreBC auf die Genexpression in S. aureus näher untersucht. Auf Ebene des Transkriptoms, Proteoms und Metaboloms konnte so die essentielle Bedeutung des NreBC-Systems für die Expression der dissimilatorischen Nitrat- und Nitritreduktasen in S. aureus nachgewiesen werden. Der dritte Teil dieser Arbeit beschäftigt sich mit der Einordnung des anaeroben Proteinsynthese¬musters (Proteomsignatur) in den Kontext zahlreicher anderer stressinduzierter Proteomsignaturen von S. aureus. Die aus diesem komplexen Vergleich gewonnenen Ergebnisse geben detaillierte Einblicke in die Spezifitäten und Gemeinsam¬keiten der Proteinsynthese von S. aureus als Reaktion auf oxidativen Stress (H2O2, Diamid und Paraquat), nitrosativen Stress (NO), Sauerstofflimitation in An- und Abwesenheit von Nitrat, Hitzestress (48°C) sowie subinhibitorische Antibiotikakonzentrationen (Puromycin, Mupirocin). Für die Bereitstellung der entsprechenden Daten wurde im Rahmen dieser Arbeit zudem ein mySQL-basiertes System entwickelt, das die Visualisierung der Daten mit komplexen Abfrage- und Filtermöglichkeiten verknüpft (http://www.aureolib.de). Im letzten Teil gibt diese Arbeit schließlich einen Überblick über die Leistungen und Möglichkeiten der Proteomanalyse hinsichtlich physiologischer und infektionsrelevanter Fragestellungen. Besondere Beachtung findet hier die Aufklärung und Struktur des bereits erwähnten Rex Modulons.
The iron-regulated surface determinant protein B (IsdB) of Staphylococcus aureus is involved in the acquisition of iron from hemoglobin. Moreover, IsdB elicits an adaptive immune response in mice and humans. Here, we show that IsdB also has impact on innate immunity. IsdB induces the release of proinflammatory cytokines, including IL-6 and IL-1β, in innate immune cells of humans and mice. In silico analysis and thermophoresis show that IsdB directly binds to TLR4 with high affinity. TLR4 sensing was essential for the IsdB-mediated production of IL-6, IL-1β, and other cytokines as it was abolished by blocking of TLR4-MyD88-IRAK1/4-NF-κB signaling. The release of IL-1β additionally required activation of the NLRP3 inflammasome. In human monocytes infected with live S. aureus, IsdB was necessary for maximal IL-1β release. Our studies identify S. aureus IsdB as a novel pathogen-associated molecular pattern that triggers innate immune defense mechanisms.
In vitro and in vivo analyses of mono- and mixed-species biofilms formed by microbial pathogens
(2022)
Microbial biofilms can be defined as multicellular clusters of microorganisms embedded in a self-produced extracellular matrix (ECM), which is primarily composed of polymeric biomolecules. Biofilms represent one of the most severe burdens in both industry and healthcare worldwide, causing billions of dollars of treatment costs annually because biofilms are inherently difficult to prevent, treat, and eradicate. In health care settings, patients suffering from cystic fibrosis, or patients with medical implants are highly susceptible to biofilm infections. Once a biofilm is formed, it is almost impossible to quantitatively eradicate it by mechanical, enzymatical, chemical, or antimicrobial treatment. Often the only remaining option to fully eradicate the biofilm is removing of the infected implant or body part. The primary reasons for the inherent resistance of biofilms against all forms of antimicrobial treatment are (I) a reduced metabolic activity of biofilm-embedded cells climaxing in the presence of metabolic inactive persister cells, as well as (II) the protective nature of the biofilm matrix acting as a (diffusion) barrier against antimicrobials and the host immune system. Consequently, there is an urgent need to better understand microbial biofilms from a structural and (patho-) physiological point of view in order to be able to develop new treatment strategies.
Therefore, the aims of this study were to investigate fundamental physiological properties of different clinically relevant single and multi-species biofilms, both in vitro and in vivo. Furthermore, the effectiveness of a novel treatment strategy using cold atmospheric pressure plasma was evaluated in vitro to treat biofilms of the pathogenic fungus C. albicans.
In article I, the intracellular and ECM protein inventory of Staphylococcus aureus during in vitro biofilm growth in a flow reactor was analyzed by liquid-chromatography coupled to tandem mass-spectrometry (LC-MS/MS) analysis combined with metabolic footprint analysis. This analysis showed that anaerobiosis within biofilms releases organic acids lowering the ECM pH. This, in turn, leads to protonation of alkaline proteins – mostly ribosomal proteins originating from cell lysis as well as actively secreted virulence factors – resulting in a positive net charge of these proteins. As a consequence, these proteins accumulate within the ECM and form an electrostatic network with negatively charged cell surfaces, eDNA, and metabolites contributing to the overall biofilm stability.
In article II, the in vivo metaproteome of the multi-species biofilm community in cystic fibrosis sputum was investigated. To this end, an innovative protocol was developed allowing the enrichment of microbial cells, the extraction of proteins from a small amount of cystic fibrosis sputum, and subsequent metaproteome analysis. This protocol also allows 16S sequencing, metabolic footprint analysis, and microscopy of the same sample to complement the metaproteome data. Applying this protocol, we were able to significantly enhance microbial protein coverage providing first insights into important physiological pathways during CF lung infection. A key finding was that the arginine deaminase pathway as well as microbial proteases play a so far underappreciated role in CF pathophysiology.
In articles III and IV, a novel treatment strategy for biofilms formed by the important fungal pathogen Candida albicans was evaluated in vitro. Biofilms were treated with two different sources of nonthermal plasma (with the Nonthermal Plasma Jet “kINPen09” as well as with the Microwave-induced plasma torch “MiniMIP”) and the effect on growth, survival, and viability was assessed by counting colony-forming units (CFU), by cell proliferation assays, as well as by live/dead staining combined with fluorescence microscopy, confocal laser scanning microscopy, (CLSM) and atomic force microscopy (AFM). These tests revealed that biofilms were effectively inactivated mostly on the bottom side of biofilms, indicating a great potential of these two plasma sources to fight biofilms.
Lipoproteins of Staphylococcus aureus represent a major class of surface proteins, which are anchored to the outer leaflet of the cell membrane. Although they play a key role in the immune response and virulence, the majority of lipoproteins in this organism is still of unknown function. The aim of our study was to investigate the function of so far poorly or uncharacterized lipoproteins in S. aureus strain Newman. To this end, an integrated bioinformatical approach was applied to define the pan-lipoproteome of 123 completely sequenced S. aureus strains. In total, this analysis predicted 192 different potential lipoproteins, with a core lipoproteome of 39 and a variable lipoproteome of 153 lipoproteins. Out of those 192 lipoproteins, 141 are so far functionally uncharacterized. Primarily focusing on members of the core-lipoproteome with unknown or poorly characterized function, 24 lipoproteins or co-encoded neighbor proteins were selected for further characterization. Of those 24 proteins, 20 S. aureus markerless deletion mutants were constructed (S. aureus delta l01 - delta l20) and screened for an altered growth behavior under various conditions. Here, three mutants showed a temperature-sensitive phenotype, two mutants formed aggregates in the TSB of the manufacturer Merck (TSBMerck), and four mutants showed reduced growth under osmotic stress with 8% NaCl. An altered aggregation behavior was observed for four mutants in the presence of Triton X-100 and for eleven mutants in the presence of SDS. Furthermore, ten mutants revealed an impaired biofilm formation capacity as well as reduced hemolytic activity. Interestingly, S. aureus deletion mutants delta l14 (delta NWMN_1435) and delta l16 (delta NWMN_0646) showed an altered phenotype under nearly all tested growth and stress conditions. Most strikingly, both deletion mutants demonstrated dramatic defects in cell morphology and cell division during the transient growth phase in TSBMerck and were therefore selected for further detailed characterization. Electron microscopy imaging of the two mutants revealed an irregular cell shape, increased cell size, multiple displaced division septa, and incomplete separation of daughter cells resulting in the formation of cell aggregates in TSBMerck. Complementarily, microarray-based transcriptome analysis and whole-genome sequencing of S. aureus delta l14 and delta l16 suppressor mutants strongly point to a functional association of both lipoproteins with cell envelope- or cell division-related processes. Specifically, multiple hints suggest a functional connection of both lipoproteins with lipo- or wall teichoic acids. Of note, the phenotypes of S. aureus delta l14 and delta l16 are conditional and appear under some, but not all growth conditions. Thus, it is conceivable that the function of L14 and L16 is modulated by metabolic processes, or that the proteins might be part of a “backup system” becoming important only under certain conditions. Collectively, we propose that L14 and L16 fulfill a basic role in cell envelope- or cell division-related processes under specific growth conditions. Particularly, the activity of L14 and L16 might be necessary for the function or localization of lipo- or wall teichoic acids, and thus, might be linked to the regulation of autolysins. In conclusion, this study reveals important insights into the function of two so far uncharacterized but highly conserved lipoproteins in S. aureus.
Staphylococcus (S.) aureus is the most common cause of nosocomial infections and the species is becoming increasingly resistant to antibiotics. In contrast, about 35% of the healthy population are colonized with S. aureus in the anterior nares. The genetic make-up of this species is highly diverse. Mobile genetic elements comprise about 15% of the S. aureus genome. They encode many virulence factors like the 21 different known staphylococcal superantigens (SAgs), highly potent activators of T lymphocytes. Besides their well known causative role in food poisoning and toxic shock syndrome, information about SAg involvement in pathogenesis is limited. On the other hand, the human host and its immune response are also highly diverse. This study focuses on SAgs, because they are potent virulence factors that are highly diverse and therefore mirror of the variability of the species S. aureus. The goals of this work were (i) to identify virulence determinants by comparing the prevalence of SAg genes and phages among colonizing and invasive S. aureus isolates and to correlate it with the clonal background, (ii) to determine the prevalence and the development of anti-SAg antibodies in healthy S. aureus carriers and noncarriers as well as in bacteremia patients, and (iii) to elucidate the reasons for the selective lack of neutralizing serum antibodies specific for a subgroup of SAgs, the egc SAgs. In search for a molecular-epidemiological associations between SAgs and different diseases caused by S. aureus we investigated the distribution of SAg genes and/ or bacteriophages and correlated this with the clonal background, determined by spa genotyping. The analysis of more than 700 S. aureus isolates from nasal colonization, bacteremia or furunculosis revealed that SAg-encoding mobile genetic elements and bacteriophages were strongly associated with the clonal background. As a consequence, each clonal lineage was characterized by a typical SAg gene and phage repertoire. Therefore, we suggest that the simultaneous assessment of virulence gene profiles and the genetic background strongly increases the discriminatory power of genetic investigations into the mechanisms of S. aureus pathogenesis. However, we found no association of SAg genes with bacteremia or furunculosis. While functional neutralization assays closely mimic the protective action of anti-SAg antibodies in vivo, they are labor-intensive and time-consuming. A fast and easy method for the simultaneous quantification of antibody binding to multiple staphylococcal antigens is the Luminex® technology. Using serum samples from persistent carriers and noncarriers we showed a strong correlation between antibody binding and neutralizing capacity against the SAg TSST-1. This assay confirmed the astonishing lack of antibodies against egc SAgs in healthy carriers and noncarriers, which was previously described by Holtfreter and coworkers. Since colonization is probably not sufficient to induce a robust antibody response as revealed by experimental colonization with S. aureus, we propose that (minor) infections are required to induce the high titers of non-egc SAg-neutralizing antibodies in healthy adults. To test this, we investigated whether SAgs elicit a neutralizing antibody response during S. aureus bacteremia. At the acute phase of the disease most patients already had neutralizing antibodies against non-egc SAgs, and antibody titers frequently increased during infection. Notably, egc SAgs did not elicit a boost or de novo generation of specific antibodies. The “egc gap” in the antibody response, which has now been shown in healthy adults, as well as following systemic infection with S. aureus, is astonishing. After all, egc SAgs are by far the most prevalent SAgs. In search for an explanation, the intrinsic properties of three recombinant egc (SEI, SElM, SElO) and non-egc SAgs (SEB, SElQ, TSST-1) were compared in depth. Egc and non-egc SAgs were very similar with regard to induced T cell proliferation, cytokine profiles, and gene expression of human immune cells. However, there was a striking difference in the regulation of the two groups of SAgs by S. aureus in bacterial culture. We conclude that the differential regulation of egc and non-egc SAg has an impact on the immune response. But how are SAgs regulated by S. aureus during its interaction with the host? Up until now most research on regulation of virulence factors has been performed in vitro. The immune response can help to shed light on this problem, because it is an exquisitely specific sensor for the exposure to different antigens. The high prevalence of neutralizing serum antibodies against non-egc SAgs indicates that most healthy adults have been exposed to these toxins during their encounters with S. aureus. For egc SAgs this remains an open question. However, initial data indicate that the egc SAg genes are transcribed during nasal colonization.
Staphylococcus aureus ist ein ubiquitär verbreitetes Bakterium. Häufig als Kommensale des Menschen vorkommend, zählt das Bakterium jedoch zu einem der wichtigsten Infektionserreger des 21. Jahrhunderts. Neben lokalen Infektionen (z. B. Furunkel) kann der Erreger nach einer Besiedlung auch systemische Erkrankungen in seinem Wirt (z. B. Sepsis, Endokarditis, Pneumonie) hervorrufen. Die pathogene Wirkung von S. aureus ist auf die Produktion und Sekretion von Pathogenitäts- bzw. Virulenzfaktoren, unter anderem Superantigene, hämolytische Toxine, Gewebe-zerstörende Enzyme und Oberflächenproteine, welche ihrerseits mit dem Immunsystem des Wirtes interferieren, zurückzuführen. Ziel dieser Arbeit war unter anderem die Analyse des extrazellulären Proteoms von S. aureus RN1HG in pMEM, ein an das bakterielle Wachstum adaptierte Zellkulturmedium. Bei den extrazellulären Proteomanalysen von S. aureus RN1HG konnten 39 Proteine identifiziert werden, welche dem Bakterium eine Interaktion mit dem Wirt (Clumping-Faktoren) ermöglichen, die Phagozytose (Protein A) verhindern oder die Ausbreitung im Gewebe (alpha-Hämolysin, gamma-Hämolysin, Lipase) erleichtern. Da die Zusammensetzung des extrazellulären Proteoms durch diverse Regulons (z. B. agr-System, sarA, sigB) bestimmt wird, stellte sich die Frage, inwiefern diese einen Einfluss auf die Virulenz des Stammes RN1HG-Stamm haben. Ein vielfach in der Literatur diskutierter Regulator ist SigB. Die vergleichende gelfreie LC-MS/MS-Analyse des extrazellulären Proteoms von S. aureus RN1HG mit einer sigB Deletion (RN1HG delta sigB) zeigte, dass sich im Vergleich zum Wildtyp die Zusammensetzung des extrazellulären Proteoms nicht grundsätzlich ändert. Jedoch konnte durch eine „labelfreie“ Quantifizierung eine verstärkte Akkumulation zahlreicher Virulenzfaktoren (z. B. Aureolysin, 1-Phosphatidylinositol- Phosphodiesterase, alpha-Hämolysin, gamma-Hämolysin, Lipase, Thermonuklease) in der delta sigB Mutante nachgewiesen werden. Die Serin-Proteasen A, C und E konnten nur für die delta sigB Mutante identifiziert werden. Adhäsine, darunter Clumping-Faktoren oder Elastin-Bindeprotein, wurden lediglich während der exponentiellen Wachstumsphase für die delta sigB Mutante nachgewiesen. Dies konnte für clf auch durch Transkriptomanalysen belegt werden. Die gelfreien Analysen wurden durch gelbasierte Verfahren (2D-Gelelektrophorese) ergänzt. Neben der Erstellung einer Referenzkarte des extrazellulären Proteoms von S. aureus RN1HG (Wildtyp und delta sigB Mutante) wurden quantitative gelbasierte Daten erhoben, die einerseits die Ergebnisse der gelfreien Analysen bestätigten, andererseits aber auch zeigten, dass SigB nur wenig Einfluss auf die Prozessierung und posttranslationale Modifikation extrazellulärer Proteine in S. aureus RN1HG hat. Die Zusammensetzung des extrazellulären Proteoms ist vor allem bei pathogenen Bakterien bedeutsam, da z. B. durch extrazelluläre Enzyme die Erschließung von Nährstoffquellen in extremen Habitaten begünstigt und durch Virulenzfaktoren sowohl die Kolonisierung als auch die Überlebensfähigkeit im Wirtsorganismus gesichert wird. Um die Erreger-Wirt Interaktion näher zu charakterisieren, wurde die Reaktion von humanen bronchialen Epithelzellen (S9-Zellen) auf eine Infektion mit S. aureus RN1GH pMV158 untersucht. Die Durchführung der Infektionsstudien mit einem GFP-markierten RN1HG-Stamm ermöglichte die Sortierung der infizierten S9-Zellen durch die Durchflusszytometrie. Da im Epithelverband nicht jede Zelle mit S. aureus infiziert ist, lag der Vorteil der Sortierung darin, dass Proteomanalysen spezifisch für die S9-Zellen mit internalisierten Staphylokokken durchgeführt werden konnten. Infolge einer Internalisierung von S. aureus durch die S9-Epithelzellen kam es zunächst zu einer Integrin-vermittelten Adhäsion. Eine zunehmende Inkubation mit S. aureus führte zu inflammatorischen Prozessen. Die Invasion pathogener Bakterien in Wirtzellen führt somit zum Remodelling biologischer Prozesse, die dem Wirt die Auseinandersetzung mit dem Pathogen ermöglichen.
Das humanpathogene Bakterium Staphylococcus aureus kann verschiedene, zum Teil lebensbedrohliche Erkrankungen wie Hautinfektionen (Furunkel, Karbunkel), Lungen-entzündung, Osteomyelitis (Knochenmarksentzündung), Endokarditis (Entzündung der Herzinnenhaut) und Sepsis auslösen. Dabei gehört S. aureus zu den häufigsten Erregern von Krankenhausinfektionen, sogenannten Nosokomialinfektionen. Deren Behandlung mittels Antibiotika stellt aufgrund von multiplen Antibiotikaresistenzen von S. aureus eine immer größere Heraus¬forderung dar, da dieser fähig ist, sich rapide an verändernde Umweltbedingungen anzu¬passen. Die Interaktion des pathogenen Bakteriums mit seiner Umwelt und seinem Wirt ist insbesondere durch den Proteinbestand, der auf der Zelloberfläche exponiert ist, bestimmt. S. aureus exprimiert ein Arsenal an Zellober-flächen-gebundenen Virulenzfaktoren, die zur Kolonisierung und Infektion von humanem Gewebe führen. Ziel dieser Arbeit war die Entwicklung und Anwendung von Massen¬spektrometrie-basierten Methoden zur Identifizierung und Quantifizierung der Zellober¬flächen¬-assoziierten Proteine von S. aureus. Dabei ist es gelungen, durch die Gel-freien und GeLC-MS/MS-basierten Methoden Biotinylierung und Trypsin-Behandlung 77% aller be-kannten Oberflächenproteine und zwei Drittel aller nach außen ragenden Membran-veran-kerten Lipoproteine von S. aureus zugänglich zu machen. Bei der Biotinylierung handelt es sich um eine Methode, bei der die Oberflächenproteine von intakten Zellen mit einem membranimpermeablen Reagenz markiert und anschließend über Affinitäts¬chroma-tographie aufgereinigt werden. Dagegen erfolgt bei der Trypsin-Behandlung die proteo-lytische Abspaltung der Oberflächen-exponierten Protein¬domänen. Erstmalig ist durch Markierung der Proteine mit stabilen Isotopen, dem sogenannten 14N/15N-metabolischen Labeling, auch eine relative Quantifizierung der Oberflächenproteine von S. aureus möglich. Bei der Analyse des Oberflächenproteoms von wachsenden und nicht-wachsenden S. aureus Zellen konnten mittels Biotinylierung 146 Oberflächenproteine identifiziert werden. Durch relative Quantifizierung wurde gezeigt, dass Zelloberflächen-assoziierte Adhäsine von S. aureus, wie der Fibrinogen-bindende clumping Faktor B, vorzugsweise während des Wachstums exprimiert werden, während nicht-wachsende Zellen erhöhte Mengen an clumping Faktor A aufweisen. Desweiteren war die Menge an immunodominanten Antigen B auf der Zelloberfläche in der stationären Phase mehr als 10-fach erhöht. Bei dieser Arbeit wurde erstmalig das Gesamt¬proteom des Methicillin-resistenten Staphylococcus aureus COL, bestehend aus cytosolischem, extra¬zellulärem, Membran- und Oberflächenproteom, um¬fassend identifiziert und quantifiziert (Becher et al., 2009). Um die Pathogenität von S. aureus näher zu erforschen, wurde das Oberflächenproteom des Wildtyps mit dem einer sigB-Mutante verglichen. Der alternative Sigma-Faktor SigmaB kontrolliert ein großes Regulon bestehend aus etwa 300 Genen, von denen viele in die Virulenz von S. aureus involviert sind. Durch Kombination von 14N/15N-metabolischen Labeling, Biotinylierung und GeLC-MS/MS konnten 98 Oberflächen-proteine quantifiziert werden. Von den 49 Proteinen, die in der sigB-Mutante verändert vorlagen, waren 21 schon als SigmaB-abhängig oder durch SigmaB beeinflusst bekannt. In dieser Arbeit konnten weitere 28 Oberflächenproteine erstmalig als SigmaB-abhängig beschrieben werden. Die Gruppe der Zelloberflächen-assoziierten Proteine und Virulenz-faktoren, die durch SigmaB beeinflusst werden, wurde so erweitert (Hempel et al., 2010). Durch Trypsin-Behandlung wurden insgesamt 63 Oberflächen¬proteine beim Vergleich vier verschiedener S. aureus Stämme identifiziert. Hierbei konnte gezeigt werden, dass das Oberflächenproteom verschiedener S. aureus Stämme extrem variabel ist. Weniger als 10% der identifizierten Oberflächenproteine aller vier Stämme stimmten überein (Dreisbach et al., 2010). Eine optimale Analyse der Oberflächen¬proteine von S. aureus wird durch eine Kombination von Biotinylierung und Trypsin-Behandlung erreicht. Es konnte gezeigt werden, dass Sortase-Substrate insbesondere durch Trypsin zugänglich sind, während Lipoproteine optimal durch Biotinylierung analysiert werden können. Das Protokoll zur Trypsin-Behandlung wurde modifiziert, stark vereinfacht und ist auch zur Quantifizierung von Oberflächen¬proteinen geeignet. Durch Kombi¬nation beider Methoden mit 14N/15N-metabolischen Labeling konnten 221 Oberflächen¬proteine identifiziert und 158 quantifiziert werden. Hierbei wurde S. aureus unter Eisenmangel-bedingungen untersucht. In den Körperflüssigkeiten von Säugetieren herrschen Eisenmangelbedingungen, und diese fungieren als wichtiges Wirtssignal für die Bakterien um Virulenzproteine zu exprimieren. Unter diesen infektionsrelevanten in vitro Bedingungen wurden insbesondere Zelloberflächenproteine wie die eisenabhängigen Häm-bindenden Proteine IsdA, IsdB, IsdC und IsdD, sowie lipidver¬ankerte Eisen-bindende Proteine stark induziert gefunden (Hempel et al., unpublished).
SUMMARY To date, Staphylococcus aureus is the most common cause of nosocomial infections and the species is becoming increasingly resistant to antibiotics. Beyond this, S. aureus colonises the nasal mucosa of circa 35% of the healthy population, so-called carriers. Importantly, S. aureus nasal carriage is a major risk factor for the development of S. aureus infections, which are commonly caused by the colonising strain. This underlines the importance of host factors for the outcome of S. aureus-host interactions. Despite the clinical importance of nasal carriage, little is known about humoral immune responses triggered by colonisation. Therefore, this thesis was focussed on the anti-staphylococcal antibody responses of S. aureus carriers and noncarriers. Staphylococcal superantigens (SAgs) served as indicator antigens for our studies. SAgs are virulence factors with extraordinary variability in the species S aureus and act as extremely potent T cell mitogens. To date, 19 different SAg gene loci are known in the species S. aureus, but molecular-epidemiological studies on the distribution of these genes are limited. Therefore, we established five multiplex PCRs for the detection of all known SAgs. With this robust and high-throughput technique we analysed the SAg gene patterns of more than 300 isolates, including 107 nasal isolates of S. aureus carriers and 88 blood culture isolates of hospital patients from Western Pomerania. The SAg gene patterns were highly heterogeneous, which can be explained by their localisation on mobile genetic elements (MGE), such as genomic islands, pathogenicity islands, phages and plasmids. Most isolates (~80%) harboured SAg genes, on average five to six, and SAgs of the enterotoxin gene cluster (egc) were by far the most prevalent. Additionally, we observed a strict correlation between the presence of SAg genes and the T cell mitogenic potency of clinical isolates. SAg-encoding MGEs can be distributed by two distinct mechanisms: horizontal transfer by bacteriophages and vertical transmission to daughter cells. To investigate the distribution of SAg genes within the S. aureus population, we determined the clonal relationship of our isolates by spa genotyping. Interestingly, SAg-gene encoding MGEs were not randomly distributed, but rather closely linked to clonal lineages. Each clonal lineage was characterised by defined combinations of SAg genes. These data suggest that the simultaneous assessment of virulence gene profiles and the genetic background strongly enhances the discriminatory power of genetic investigations into the mechanisms of S. aureus virulence. Indeed, the comparison of virulence genes within each clonal complex indicated a role in invasiveness for some MGEs, e.g. the exfoliative toxin D-encoding pathogenicity island, while rendering it unlikely for SAgs. It is known that neutralising serum antibodies against the SAgs SEA, SEB, SEC, SED and TSST-1 are frequently present in healthy individuals. However, the neutralising antibody profiles against more recently described SAgs or complex SAg cocktails as secreted by clinical isolates had not been determined so far. Therefore, we screened more than 100 sera for their SAg neutralising capacity with a neutralisation assay. We observed a marked heterogeneity and surprisingly large “gaps” in the neutralising capacity. Interestingly, the egc SAgs were inhibited only rarely (5-10%), whereas between 32 and 86% of the tested sera neutralised “classical” SAgs. This “egc gap” in the SAg-neutralising antibody profiles of healthy individuals was unexpected, since egc SAgs are by far the most prevalent SAgs. We could demonstrate that the “egc gap” is probably not due to different T cell activating properties of egc SAgs compared to classical SAgs, but rather to a differential regulation of SAg gene expression. S. aureus carriers have an increased risk of developing an S. aureus bacteraemia, which is in most cases caused by the colonising strain. Intriguingly, a large prospective clinical trial revealed a considerably higher mortality in noncarriers with invasive S. aureus strains compared to carriers with invasive disease. To explain these paradoxical findings, we hypothesised that in carriers partial immunity against the colonising strain may contribute to their improved outcome. We used SAgs as strain-specific indicator antigens. Importantly, sera from persistent carriers neutralised SAgs of their colonising strain with significantly higher efficiency than sera from noncarriers. This antibody response was strain-specific, since the antibody response of carriers against other SAgs did not differ from that of noncarriers. Thus, colonisation with S. aureus confers a strong and strain-specific antibody response against staphylococcal SAgs. We suggest that in carriers neutralising antibodies directed against SAgs and other staphylococcal virulence factors confer partial protection during systemic infections. This could explain the better prognosis of carriers with S. aureus bacteraemia compared to noncarriers. Moreover, our data imply that the key to understanding the pathogenesis of S. aureus disease may lie in the identification of host factors rather than bacterial factors. Such host factors could be the immune status and gene polymorphisms that contribute to colonisation, susceptibility to infection and outcome of infection. Finally, while the treatment of S. aureus bacteraemia with pooled immunoglobulins was performed in the past without significant success, our findings on strain-specific antibody profiles suggest that therapies with customised cocktails of monoclonal antibodies could have a higher efficacy.
Infektionen durch Staphyloccocus aureus können aufgrund zunehmender Therapieresistenz (ca-MRSA, ha-MRSA, la-MRSA etc.) gravierende Verläufe nehmen und stellen nicht nur eine wachsende medizinische, sondern auch eine gesundheitsökonomische Herausforderung im Patientenmanagement dar. Für die Entwicklung innovativer Behandlungsstrategien ist die genaue Analyse der keimspezifischen Infektionsmechanismen eine wichtige Voraussetzung. S. aureus verwendet sogenannte Virulenzfaktoren um einen zunächst lokalen Infektionsherd zu etablieren. Wachstumsphasenabhängig werden z.B. Adhäsine, Kapselantigene oder Toxine exprimiert, um dann gezielt im Infektionsgeschehen eingesetzt zu werden. In den vergangenen Jahren konnten wichtige Fortschritte zur Ermittlung infektionsrelevanter stammspezifischer Regulationsmechanismen bei S. aureus gemacht werden. Ziel dieser Arbeit war zunächst eine Datengrundlage zur Untersuchung der Wirt-Erreger-Interaktion durch Proteomreferenzkarten von humanen S9-Epithelzellen zu schaffen. Zudem wurden die extrazellulären Expressionsmuster von S. aureus-Isolat NCTC8325-4 in verschiedenen Kulturmedien analysiert, um ein geeignetes Medium für die Kokultur der Wirts –wie auch der Erregerzellen entwickeln. Weiterhin sollte eine Proteomreferenzkarte der extrazellulären Proteinfraktion von S.aureus RN1HG erstellt werden, um eine anschließende Vergleichsanalyse der wachstumsphasenabhängigen Expressionsprofile zu ermöglichen. Zur Erstellung der Proteomreferenzkarten wurden die Proteingemische mit einer zweidimensionalen Gelelektrophorese (2D PAGE) aufgetrennt. Zuerst wurden die Proteine einer isoelektrischen Fokussierung unterworfen (IPG – Streifen 24cm für pI 4-7; 11cm u. 18cm für pI 6-11) und dann in der zweiten Dimension nach ihrer Größe mit 12,5% SDS Polyacrylamidgelelektrophorese separiert (Trennbereich 20 -120 kD). Die Proteinspots wurden mit verschiedenen Färbemethoden (Silbernitrat, kolloidales Coomassie Brillantblau oder Flamingo Fluoreszenzfärbung) dargestellt. Mit MALDI-TOF wurden die Proteine sequenziert und quantifiziert. Die gefundenen Sequenzen wurden durch Datenbanksuche (Mascot 2.0; SwissProt 55.1_human/all) identifiziert. Auf Wirtsseite sollten die humanen S9-Epithelzellen (CFTR repaired IB3-1) als Modell einer bakteriellen Atemwegskolonisation dienen, dabei wurden sie in MEM (mit 4% FCS, 1% NEAA (non essential amino acids) und 4 mM L-Glutamin) kultiviert. Auf der Erregerseite wurden die S. aureus - Isolate NCTC8325-4 (11-bp deletion in rsbU, cured of three prophages) und RN1HG (rsbU restored) (HG001; Herbert S. et al, 2010) verwendet . Proteomreferenzkarten für den pI Bereich pI 4-7 und pI 6-11 wurden für das Proteom der S9-Epithelzellen angefertigt. Es wurden 668 Einzelproteine (508 mit Proteinscore >55) identifiziert und funktionell via Datenbanksuche (www.pantherdb.org) charakterisiert. Somit können infektionsassoziierte Veränderungen im Proteinmuster der S9-Wirtszellen erkannt und valide ausgewertet werden. Um eine Kokultur für Internalisierungsversuche von S.aureus und den S9-Epithelzellen zu ermöglichen, wurde eine methodenoptimierende Kultivierungsreihe (MEM mit und ohne 5%FCS, RPMI 1640, TSB) mit dem Laborstamm NCTC8325-4 durchgeführt. Der Datenvergleich der extrazellulären Expressionsmuster trug zur Entwicklung eines geeigneten Kulturmediums (MEM mit 2mM AS supplementiert) bei. S. aureus RN1HG wurde in diesem Medium kultiviert und von der extrazellulären Proteinfraktion wurde eine Proteomreferenzkarte im Bereich pI 4-7 angefertigt. Es konnten 91 Einzelproteine (48 mit Proteinscore >55) identifiziert werden. Durch eine vergleichende Analyse konnten Veränderungen der Proteinmuster innerhalb verschiedener Wachstumsphasen (exponentiell, transient, stationär und spät stationär) detektiert und ein optimaler Erntezeitpunkt festgelegt werden. Während der exponentiellen Wachstumsphase waren typischerweise kolonisationsrelevante Proteine (LytM, SAOUHSC_02979, SceD), in der stationären Phase vorrangig invasionsrelevante (SsaA, IsaA, SspB) angereichert. Somit konnten charakteristische Expressionsmerkmale bei S. aureus RN1HG nachgewiesen werden, welche den weiteren Einsatz gemeinsam mit den S9-Epithelzellen ermöglichen (Schmidt F. et al., 2010).
Staphylococcus aureus (S. aureus) is among the most common infectious agents, burdening the
global health care system and challenging physicians. Thus, the demand for vaccination is
increasing, and despite many attempts, no vaccine is currently available. The iron-regulated
surface determinant protein B (IsdB) is a highly conserved surface protein of S. aureus. It has
an essential role in bacterial iron acquisition and cell attachment, functioning as a fitness factor.
It has been shown that IsdB is critical for S. aureus virulence and growth in iron-restricted
conditions, such as the human host. Therefore, IsdB was studied as a vaccine candidate. A nonadjuvant vaccine (V710) was developed based on IsdB, which showed promising results in the
preclinical, phase I, and phase IIa trials. Unexpectedly, in a phase IIb/III, in cardiothoracic
surgery patients that were infected by S. aureus, mortality was significantly higher in the
vaccinated group than the placebo. Despite increased antibody levels against IsdB in the
vaccinated patients, V710 failed to prevent S. aureus infection. Therefore, a better
understanding of the interaction between S. aureus and the immune system is required.
We have discovered that IsdB has an important role in host-pathogen interaction. This bacterial
protein activated human monocytes and murine bone marrow-derived dendritic cells
(mBMDCs) to produce proinflammatory cytokines, such as IL-6, TNF-α, IL-12, IL-23, IL-33,
and IL-1β. In silico molecular docking and DimPlot analysis predicted that IsdB binds to -TLR4
via non-covalent interactions. Microscale thermophoresis confirmed that IsdB has a high
affinity to recombinant human TLR4 in the nanomolar range. Inhibition of TLR4 completely
abolished the production of all the cytokines mentioned above in both cell types. Furthermore,
we characterized the TLR4 signaling pathway triggered by IsdB. In human monocytes, blocking
the myeloid differentiation factor 88 (MyD88) adaptor protein and NF-κβ transcription factor
caused complete abrogation of proinflammatory cytokines in response to IsdB, revealing that
IsdB induces cytokine release via the TLR4-MyD88-NF-κβ dependent pathway.
The consistent release of IL-1β suggested that IsdB induced activation of the inflammasome, a
multi-molecular complex known to play a crucial role in innate immunity. We corroborated our
observations in human monocytes and mBMDCs by inhibiting essential components of the
NLRP3 inflammasome. Blocking NLRP3, caspases in general and caspase-1 completely
inhibited the release of IL-1β. In monocytes, IsdB alone was sufficient to induce NLRPdependent IL-1β release, suggesting an alternative pathway of inflammasome activation. In
contrast, mBMDCs required an additional stimulus, such as ATP or MSU (known stress
signals) besides IsdB, to release IL-1β, indicating a classical inflammasome activation. These
results demonstrate that IsdB induces the release of IL-1β via the TLR4-NLRP3-Caspase-1
axis. Next, we addressed the molecular mechanisms involved in IsdB-induced IL-1β in monocytes.
A low concentration of intracellular potassium (K+) resulting from K+ efflux is known to trigger the NLRP3 inflammasome-mediated IL-1β release. We demonstrated that blocking potassium efflux by inhibition of ion channels, such as pannexin channels (P2X)7, and addition of extracellular KCl significantly reduced IsdB-induced IL-1β. Other common inflammasome activators, such as phagolysosome rupture and reactive oxygen species (ROS), did not contribute to the release of IL-1β in response to IsdB. In summary, we revealed yet another role of IsdB beyond iron acquisition from Hb and attachment to the host cells via vitronectin and integrins. It is conceivable that IsdB’s interaction with innate immune cells modulates the quality of the adaptive immune response, showing a new facet in the pathogen-host relationship of S. aureus that should be considered in future
vaccine development.
Reversible posttranslational modifications play an important role during the regulation of many central processes in bacterial cells. Protein phosphorylation, in particular, can influence signal transduction processes and thus enables a distinct reaction of the cell to different stress and environmental conditions. In the case of the human pathogen Staphylococcus aureus, protein phosphorylation is involved in the adaptation to changing conditions during colonisation of human hosts. For this reason, the investigation of phosphorylations in S. aureus allows a better understanding of pathophysiology and virulence of this organism. Apart from stable phosphorylations at the amino acids serine, threonine and tyrosine, insights into energy-rich phosphorylations, for instance at arginine residues, gain more and more scientific attention. For this reason, one purpose of this study was the investigation of incidence and physiological relevance of this protein modification at a global scale. Firstly, the analysis of this modification was methodically optimised resulting in the identification of eight arginine phosphorylations in wild type cells of S. aureus COL. Secondly, the deletion mutant ΔptpB missing the gene that codes for an arginine phosphatase, was analysed. The characterisation of PtpB in vitro proved its activity and specificity towards arginine phosphorylations. This enabled the global analysis of the phosphoproteome with a focus on arginine phosphorylations. In addition to the optimisation of the phosphopeptide enrichment as part of the sample preparation, the data analysis process was adapted to the special challenges of energy-rich phosphorylations. Here, classical database search was extended by spectral library based analyses. In addition, synthetic peptides allow the generation of high quality mass spectra and the verification of database based evaluation strategies to ensure the quality of the spectral library. Next, S. aureus COL was cultivated under various conditions and several subcellular fractions were analysed with the aim to cover a broad part of the proteome. The combination of the spectra of synthetic peptides, the spectra of non-phosphorylated peptides from extensive cultivation experiments and the spectra of enriched phosphopeptides rendered the construction of a spectral library possible. This contained 2,270 proteins out of which 392 were found to be phosphorylated. A comparison of the database based analysis with spectral library based analysis showed the advantages of the latter when comparing the reproducibility of biological replicates. Thereby a permanent issue in phosphoproteomics was investigated. Hence, spectral libraries were used for the analysis of the phosphoproteome of S. aureus under control and stress conditions. 215 arginine phosphosites were identified within the mutant under control conditions and 117 under oxidative stress conditions. Oxidative stress was chosen because phenotypic characterisation of the mutant revealed that the most distinct growth changes in comparison with the wild type occurred after oxidative stress. These phenotypic changes were quantitatively approached in the last part of this work. Total proteome quantification of the wild type and mutant under control and stress conditions revealed an influence of the ptpB deletion on amino acid metabolism, oxidative stress response and virulence. The quantification of phosphopeptides by means of a combination of spectral library with Census based analysis finally confirmed the observations made during total proteome quantification.
Staphylococcus (S.) aureus ist vor allem bekannt als einer der Haupterreger nosokomialer Infektionen weltweit. Die Mechanismen, mit denen S. aureus und das Immunsystem des Wirtes miteinander interagieren sind komplex und bis heute nicht vollständig verstanden. Ziel der vorliegenden Dissertation war es daher, bekannte Virulenzfaktoren von S. aureus und Proteine, deren Funktion für das Bakterium bisher unbekannt ist, hinsichtlich ihrer Immunogenität und ihrer Fähigkeit, Interaktionen mit Zellen und Plasmafaktoren des humanen Blutes einzugehen, zu charakterisieren. Die Entwicklung und Anwendung eines für den Organismus S. aureus spezifischen Proteinmikroarray war eines der Hauptziele dieser Arbeit, welches unter der Bezeichnung Staph-Toxin-Ag verwirklicht wurde. Der Array trug bis zu 62 S. aureus-Antigene und zeigte sich als geeignet zur Charakterisierung und Quantifizierung von Antikörperantworten in verschiedenen humanen und murinen Wirtsproben, wie Blutplasma und -serum sowie anderen extrazellulären Flüssigkeiten wie Nasensekret und Bauchwasser von gesunden und infizierten Probanden. Im ‚Protein-Interaktionsassay‘ wurde der Staph-Toxin-Ag dazu verwendet, Interaktionen von S. aureus-Proteinen zu humanen Blutplasmaproteinen zu identifizieren – Faktor H, Fibronektin, Fibrinogen, Plasminogen und Vitronektin. Der Staph-Toxin-Ag wurde in zwei unabhängigen globalen Studien angewendet, welche die S. aureus spezifischen Antikörperantworten von gesunden humanen Probanden untersuchten, darunter Träger und Nicht-Träger von S. aureus. In der ersten Studie wurden die IgG-Antworten in den Blutplasmen, in der zweiten Studie die Antikörperantworten der Klassen IgG und IgA, hier in den Nasensekreten der Probenaden charakterisiert. In beiden Studien wurde wie erwartet eine enorme Heterogenität der detektierten Antikörperantworten innerhalb der Kohorten beobachtet, die unabhängig vom Trägerstatus bestand. Vergleichende Analysen der IgA- mit den IgG-Antworten in den Nasensekreten konnten den Grad der Heterogenität noch einmal deutlich erhöhen. Für keinen der untersuchten Probanden stimmten die S. aureus-Antigen-Muster beider Antikörperklassen vollständig überein. Für die untersuchten S. aureus-Träger wurden im Durchschnitt höhere Antikörperlevel nachgewiesen als für die Nicht-Träger. Statistische Analysen (Mann-Whitney U-Test) der gemessenen IgG- bzw. IgA-Level identifizierten insgesamt zehn Antigene, gegen die die Testgruppe der Träger im Vergleich signifikant höhere Antworten zeigte. Für das virulenzassoziierte Protein IsaA (Immunodominant staphylococcal Antigen A) wurden die beschriebenen Unterschiede in beiden globalen Studien und für beide untersuchten Antikörperklassen identifiziert. Die stärksten und häufigsten Antikörperantworten konnten gegen Proteine aus zwei funktionellen Gruppen – die nicht-egc-Superantigene (SEB, SEC, TSST-1) und die Komplement- und Koagulationsinhibitoren (SCIN, Efb, Sbi, SSL-7, SACOL1169) – detektiert werden. Mindestens 60 % der untersuchten Probanden zeigten spezifische IgG- und/oder IgA-Antworten gegen Komplementinhibitoren. Hingegen konnten für Superantigene vor allem Antikörperspezifitäten der Klasse IgG detektiert werden. Für den Komplementinhibitor Sbi (S. aureus Binder of IgG) wurde eine Lücke in den IgG-Antworten beobachtet. Beide funktionelle Gruppen werden folglich bei der Invasion des Wirtes von S. aureus in vivo exprimiert. Komplementinhibitoren sind darüber hinaus offensichtlich für S. aureus von besonderer Relevanz bei der Kolonisierung der Naseschleimhaut. Zahlreiche neue Erkenntnisse konnten gewonnen werden zu Proteinen, die von S. aureus sekretiert werden, deren Funktion für das Bakterium jedoch bisher unbekannt ist. Gegen zehn dieser Proteine wurden mithilfe des Staph-Toxin-Ag spezifische IgG- und/oder IgA-Antworten nachgewiesen, besonders häufig gegen die Antigene SACOL0479, SACOL0480, SACOL0985 und SaurJH1_2034. Dies zeigte, dass diese Proteine durch S. aureus in vivo synthetisiert werden und dass sie immunogen wirken. Im ‚Protein-Interaktionsassay‘ konnten für 20 der sekretierten Proteine mit unbekannter Funktion Interaktionen mit humanen Blutplasmafaktoren nachgewiesen werden. In durchflusszytometrischen Analysen mit humanem Vollblut wurden für sieben Proteine – SACOL0021, SACOL0742, SACOL0908, SACOL0985, SACOL1788, SACOL1802 und SACOL2197 – spezifische Bindungen an PMNs (Polymorphonuclear Leukocytes) und/oder Monozyten gezeigt. In der vorliegenden Dissertation wurden mithilfe immunologischer und durchflusszytometrischer Methoden potentielle neue Virulenzfaktoren, Vakzinkandiaten sowie diagnostische Biomarker identifiziert. Neben der wissenschaftlichen Anwendung ist der Proteinarray Staph-Toxin-Ag durch seine Eigenschaften prädestiniert für einen Einsatz als Screening-Methode in der diagnostischen Medizin.
Staphylococcus (S.) aureus besiedelt bei 30 % der gesunden Bevölkerung den Nasenraum, meist ohne Symptome zu verursachen (sog. Carrier). Die Bakterienspezies ist aber auch eine der häufigsten Ursachen für nosokomiale Infektionen mit zum Teil hoher Letalität, wie z. B. bei einer S. aureus-Sepsis. In den letzen Jahrzehnten haben sich multiresistente S. aureus-Isolate in und außerhalb der Krankenhäuser stark ausgebreitet. Dies lässt befürchten, dass eine erfolgreiche antibiotische Behandlung schwerer S. aureus-Infektionen in der Zukunft immer seltener möglich sein wird. Deshalb werden andere präventive und therapeutische Strategien wie Impfstoffe benötigt. Die Impfstoffentwicklung gestaltet sich jedoch schwierig. Zum einen ist die Variabilität der Spezies S. aureus sehr groß: Zwei Isolate können sich in bis zu 20 % ihres Genoms unterscheiden. Zum anderen ist auch die Immunantwort des Wirts sehr komplex. Die Mechanismen der angeborenen Immunabwehr sind bereits gut untersucht, das Zusammenspiel von S. aureus mit dem adaptiven Immunsystem dagegen weniger umfassend charakterisiert. Dabei ist gerade dies für die Vakzineentwicklung bedeutsam, denn jede erfolgreiche Vakzinierung beruht auf der Bildung eines Immungedächtnisses, der Kernkompetenz des adaptiven Immunsystems. Da sich die gegen S. aureus gerichtete adaptive Immunantwort von Individuum zu Individuum stark unterscheidet, ist die Entschlüsselung der zugrunde liegenden Mechanismen eine besondere Herausforderung. Die rasche Entwicklung von OMICs-Techniken ermöglicht nun erstmals eine umfassende Charakterisierung des Immunoms von S. aureus; der Gesamtheit der von B-Zellen (und Antikörpern) und T-Zellen erkannten bakteriellen Antigene. In dieser Arbeit sollten diese modernen Methoden eingesetzt werden, um einen Beitrag zum Verständnis der vielfältigen Interaktionen zwischen S. aureus und dem adaptiven Immunsystem zu leisten; mittelfristig soll dieses Projekt zur Entwicklung wirksamer Impfstoffe gegen S. aureus beitragen. Informativ erschien ein Vergleich der adaptiven Immunantwort bei S. aureus-Carriern und Patienten, weil er Aufschluss darüber verspricht, wie die Interaktion zwischen Erreger und Wirt in der Balance gehalten wird und was dieses Gleichgewicht stört. Weil die individuelle Antiköperantwort (IgG, IgA und IgM) in ihrer Komplexität und Variabilität erfasst werden sollte, wurde ein personalisierter Ansatz gewählt, d.h. mittels zweidimensionaler Immunoblots (2D-IB) wurde bei jedem S. aureus-Carrier oder Patienten die Antikörperantwort auf den eigenen kolonisierenden bzw. invasiven S. aureus-Stamm untersucht. Durch die Kombination mit massenspektrometrischen Analysen ließ sich das S. aureus-Immunom der Kolonisierung und der Bakteriämie herauskristallisieren. Um in der Zukunft auch S. aureus-spezifische T-Zellen charakterisieren zu können, wurde ein Verfahren für die Herstellung von humanen T-Zellbanken entwickelt, das die funktionelle Analyse von T-Lymphozyten auf Einzelzellebene ermöglicht.
Staphylococcus aureus (S. aureus) ist einer der meist gefürchtetsten pathogenen Mikroorganismen, der verantwortlich ist für eine Vielzahl von nosokomialen Infektionen und Krankheiten. S. aureus ist in der Lage, sich an verändernde Umweltbedingungen auf Ebene der Genexpression anzupassen, was zu unterschiedlichen Proteinzusammensetzungen und somit zu Veränderungen in der Metabolitenkomposition und metabolischen Aktivität führt. Außerdem stellt die Fähigkeit, Resistenzen gegen gegenwärtig genutzte Antibiotika zu entwickeln, eine Gefahr dar und macht diesen Keim in seiner Behandlung so schwierig. Für ein vollständiges Verstehen der Proteom-, Transkriptom- und Metabolomdaten ist die Untersuchung der Enzymaktivitäten ein entscheidendes Hilfsmittel. In der vorliegenden Arbeit wurden die enzymkatalytischen Eigenschaften sowie die spezifischen Enzymaktivitäten der Enzyme des Intermediär- und Fermentationsstoffwechsels untersucht. Aus Zellen der logarithmischen, transienten und stationären Wachstumsphase unter aeroben wie auch anaeroben Bedingungen wurden für die Enzyme das pH-Optimum, die maximale Reaktionsgeschwindigkeit (vmax) und die Substratkonzentration der halbmaximalen Reaktionsgeschwindigkeit (Km) bestimmt. In S. aureus COL wird die Glucose unter aeroben Bedingungen hauptsächlich über die Glycolyse metabolisiert. Glucose-6-phosphat wird weiter zu Pyruvat umgesetzt, welches wiederum durch die Pyruvat-Oxidase zu Acetylphosphat oder durch den Pyruvat-Dehydrogenase-Komplex zu Acetyl-CoA verstoffwechselt wird. Durch die Phosphatacetyl-Transferase wird das Acetyl-CoA im Folgenden ebenfalls zu Acetylphosphat umgesetzt und nicht dem Citrat-Zyklus zugeführt. Die Acetat-Kinase nutzt das Acetylphosphat zur Generierung von ATP. Geringe extrazelluläre Lactat-Konzentrationen weisen auf eine geringere Bedeutung der Lactat-Dehydrogenase unter aeroben Wachstumsbedingungen hin. Gleichwohl wird ein kleiner Teil des Pyruvates zur Regeneration von NAD+ durch die Lactat-Dehydrogenase genutzt. In der transienten und stationären Wachstumsphase werden die Gene der Enzyme für Gluconeogenese und Citrat-Zyklus vermehrt exprimiert. Lactat und Acetat werden als Kohlenstoff- und Energiequelle wieder aufgenommen und dienen der Bildung unterschiedlicher Intermediate, wie beispielsweise der Bildung von NADPH über Glucose-6-phosphat im Pentose-Phosphat-Weg. Lediglich die Citrat-Synthase, Isocitrat-Dehydrogenase und Fumarat-Hydratase des Citrat-Zyklus konnten enzymologisch untersucht werden, was auf eine geringe metabolische Aktivität im Citrat-Zyklus hinweist. Möglicherweise dient der erste Teil des Citrat-Zyklus nur der Einführung von Aminosäuren als Kohlen- und Stickstoffquelle in den Metabolismus. Unter anaeroben Bedingungen wird die Glucose in der Glycolyse und der gemischten Säuregärung zu Lactat und Ethanol umgesetzt. Hohe spezifische Enzymaktivitäten der Lactat- und Alkohol-Dehydrogenase konnten nachgewiesen werden. Die Energie in Form von ATP wird auch in dieser Phase des Wachstums durch Substratkettenphosphorylierung generiert. Bacillus subtilis 168 (B. subtilis 168) ist ein grampositives apathogenes Bakterium, das durch die Zugabe von Pyruvat auch zum Wachstum unter sauerstofffreien Bedingungen befähigt ist. Es exprimiert Enzyme der 2,3-Butandiol- und Lactatfermentation. In der hier vorliegenden Arbeit wurden die enzymkatalytischen Eigenschaften von Enzymen des Intermediär- und Fermentationsstoffwechsels untersucht. In der logarithmischen Wachstumsphase wird die Glucose über die Glycolyse verstoffwechselt. Wie bei S. aureus COL ist der Eintritt des Glucose-6-phosphates in den Pentose-Phosphat-Weg aufgrund einer höheren spezifischen Enzymaktivität der Glucose-6-phosphat-Isomerase limitiert. Die Energie in Form von ATP wird auch hier hauptsächlich über Substratkettenphosphorylierungsreaktionen generiert. Die Bedeutung der Lactat-Dehydrogenase-Aktivität unter aeroben Bedingungen ist noch nicht eindeutig geklärt, jedoch kann davon ausgegangen werden, dass auch hier ein Teil des Pyruvates zur Regeneration von NAD+ durch die Lactat-Dehydrogenase umgesetzt wird. Unter anaeroben Bedingungen wurden hohe Lactat-Dehydrogenasen-Aktivitäten gemessen. Außerdem wird die Glucose zur Regeneration von NAD+ zu D-2,3-Butandiol fermentiert. Zusammenfassend ist zu sagen, dass enzymologische Untersuchungen und die Erforschung der spezifischen Enzymaktivitäten unter bestimmten Bedingungen ein gutes Hilfsmittel für metabolische Studien ist und diese gut mit vorhandenen Proteom- und Metabolomdaten verglichen werden können. Enzymanalysen sind nicht einfach handhabbar, bieten aber die Möglichkeit, einen Blick in die Physiologie von Mikroorganismen zu werfen. Für ein allumfassendes Verständnis ist es wichtig, Enzymaktivitäten zu untersuchen.
Staphylococcus aureus is a pathogenic bacterium infecting the human host. It’s multifaced adaptation to various environmental conditions is mediated by a tight regulation of the virulence factors influencing the host’s immune system. In this thesis two regulators of gene expression were analysed: (i) the global influence of the two-component system SaePQRS and (ii) the regulation of superantigen gene expression by the alternative sigma factor σB. At the outset of this thesis, single target genes induced by SaeRS were known (hla, hlb, cap5, fnbA, coa). In order to get a general idea of the Sae-regulon, the influence of SaePQRS on gene-expression was analysed in two strain backgrounds by proteomics and transcriptomics aproaches. Recapitulatory, expression of at least 18 secreted and two covalently cell-wall bound proteins was decreased following inactivation of the Sae-system. Sae-dependently expressed were, amongst others, well decribed virulence factors like the y-hemolysins HlgA, HlgB, HlgC, LukM and LukF, the innate immune system modulating proteins Efb, CHIPS and SCIN-B as well as the enterotoxin SEB. SaeR acts as an activator of its target genes. Some proteins were detected in increased amounts in the extracellular proteome of the Sae-deficient strain. However, these changes did not occur at the transcriptional level. The expression of virulence factors is determined by other global regulators. No influence of SaePQRS on the transcription of five substancial regulators, namely the Agr-system and its effector molecule RNAIII, the alternative sigma factor σB, the two-component system ArlRS and the DNA-binding protein SarA, could be shown. In the second part of this thesis the issue was broached to the regulation of gene-expression of a subgroup of virulence factors, the superantigens (SAgs) of S. aureus by SaePQRS and σB. In contrast to their well described molecule structure and function, the regulation of their gene expression was largely unknown. Six different S. aureus strains (two laboratory strains and four clinical isolates) encoding one to seven SAg-genes each, were used for analysis of a total of twelve SAgs regarding their transcription and mitogenic activity. The transcriptional units were characterized using Northern-Blotting. The expression of SAgs could be correlated to the respective growth phase. While egc-SAgs were expressed mainly at low optical densities, seb was induced during late growth phase. In contrast, the transcription of sea, seh, sek, tst and sep remained constant and growth-phase independent. The transcriptional dataset was verified using T-cell proliferation assays. The expression of seh, tst and the egc-operon was dependent on σB. A potential σB-dependent promotor could be identified preceeding seo, the first gene of the egc-operon. In contrast, the expression of seb was increased in sigB-deficient background. This might be due to indirect effects. Expression of seb required SaePQRS. Transcriptional datasets were verified by Immuno-Blotting and T-cell-proliferation assays. In conclusion, the same mutation in sigB but in different strain backgrounds could result in opposite phenotypes with respect to their mitogenic activity. Besides well characterized virulence factors, some secreted proteins with so far unknown function belong to the Sae-regulon. Given that the influence of SaePQRS was restricted to virulence factors and induced especially modulators of the innate immune system, it can be assumed, that these proteins potentially play a role in virulence of S. aureus. In the third part of this thesis, one of these potential new virulence factors, namely SACOL0908, was analysed in detail. In cooperation with the group of Prof. Stehle, Tübingen, the crystal structure was solved. The protein folding of SACOL0908 is new with only minor similarities to described protein structures. Recombinantly expressed SACOL0908 binds to granulocytes. These cells belong to the innate immune system, incorporate bacteria by phagocytosis and kill them. The receptor for SACOL0908 on the surface of granulocytes could not be identified using immunoprecipitation, antibody-blocking assays and functional assays in cooperation with the group of Prof. Peschel, Tübingen. The gene encoding SACOL0908 was deleted in two S. aureus strain backgrounds (COL and Newman). These mutants are currently in use to characterize their phenotype in mouse-infection studies.
Für die Bekämpfung bakterieller Infektionen ist das angeborene Immunsystem von essenzieller Bedeutung. Im Rahmen dieser Promotion wurden murine angeborene Immunmechanismen bei systemischer Infektion mit Burkholderia pseudomallei, dem gram-negativen Erreger der Melioidose, sowie pulmonaler Infektion mit dem gram-positiven Erreger Staphylococcus aureus bei genetisch heterogenen BALB/c- und C57BL/6-Mäusen untersucht. Für in vitro-Untersuchungen wurde zunächst im ersten Teil eine Methode zur serumfreien Kultivierung von primären Makrophagen aus murinen Knochenmarkstammzellen unter Verwendung des lipoproteinreduzierten Serumsupplements Panexin® etabliert. Derart kultivierte Makrophagen von BALB/c- und C57BL/6-Mäusen wiesen wichtige Effektor-funktionen wie die Fc-Rezeptor-vermittelte Phagozytose und bakterizide Aktivität auf. Außerdem gelang es, die in der Literatur unter FCS-Bedingungen beschriebenen polarisierten Makrophagen-Phänotypen auch unter serumfreien Bedingungen funktionell nachzuweisen. So wiesen C57BL/6-Makrophagen im Vergleich zu BALB/c-Makrophagen ein deutlich höheres bakterizides Potenzial gegenüber B. pseudomallei auf und produzierten größere Mengen des zytotoxischen Stickoxids, unterschieden sich jedoch nicht in ihrer Fähigkeit, E. coli zu eliminieren. Im zweiten Teil der Arbeit konnte mithilfe dieses standardisierten Zellkultursystems gezeigt werden, dass Caspase-1 bereits in der Frühphase der B. pseudomallei-Infektion IFNγ-unabhängig für die bakterizide Potenz der Makrophagen erforderlich ist, die Caspase-1-Aktivität andererseits im gleichen Zeitraum jedoch eine Zunahme des zytotoxischen Erregereffektes verursacht. Durch die gestörte intrazelluläre Erregerelimination unmittelbar nach Infektion kam es im weiteren zeitlichen Verlauf zur Zunahme des erregerabhängigen Zelltodes, für den in der Literatur allerdings ursächlich auch das Fehlen verzögerter Caspase-1-abhängiger protektiver Effekte diskutiert wird. Weiterhin konnte gezeigt werden, dass Caspase-1 eine essenzielle Bedeutung für die in vivo-Resistenz und Generierung der inflammatorischen Zytokinantwort hat, welche zur Überwindung der akuten Infektion beiträgt. Während die Caspase-1-Expression bei unterschiedlich empfänglichen BALB/c- und C57BL/6-Makrophagen nach Infektion vergleichbar war, könnte die gesteigerte IL-1β-Produktion bei resistenteren C57BL/6-Makrophagen darauf hinweisen, dass unterschiedliche Aktivitäten des Enzyms in Mausstämmen mit unterschiedlichen genotypischen Eigenschaften den Verlauf der murinen Melioidose beeinflussen. Im letzten Teil dieser Dissertation wurde erstmals am Beispiel von BALB/c- und C57BL/6-Mäusen ein vergleichendes S. aureus-Pneumoniemodell entwickelt, bei dem BALB/c-Mäuse neben einer höheren Empfänglichkeit auch eine verminderte Fähigkeit aufwiesen, den Erreger aus der Lunge zu eliminieren. Während neutrophile Granulozyten für das Überleben erforderlich waren und die Organkeimzahlen signifikant zu reduzieren vermochten, steigerten Makrophagen die Mortalität, ohne jedoch Einfluss auf die Bakterienelimination zu haben. Für diese Mortalitätszunahme könnte eine überschießende Zytokinantwort mit der Folge eines Zytokinschocks verantwortlich sein. Schließlich wurde gezeigt, dass das bakterielle sae-Regulon, welches die Expression verschiedener bakterieller Proteine steuert, sowohl für die Virulenz, als auch für die intrapulmonale Persistenz des Erregers in diesem Infektionsmodell von entscheidender Bedeutung ist. Die zu beobachtenden Unterschiede in Mortalität und Organkeimzahlen belegen zugleich, dass das etablierte Mausmodell eine für die Untersuchung bakterieller Virulenzfaktoren ausreichende Sensitivität aufweist.
Understanding of the regulatory mechanisms controlling stress gene expression of S.aureus in response to environmental stress is very essential in studying its fitness and virulence. In this work, the changes in protein expression profiles as well as the gene transcription of S.aureus after heat exposure, osmotic stress and in response to the antibiotic puromycin were studied in order to provide detailed insights into the response of S.aureus to various kinds of environmental stress under in vitro conditions, namely: (1) to investigate the global response of S.aureus to heat stress conditions using transcriptomic and proteomic analyses. (2) to study the transcriptome and proteome of S.aureus in response to antibiotic substance puromycin. (3) to define the proteome signatures of S.aureus under NaCl stress condition. (4) to complete the proteome map of cytoplasmic proteins of S.aureus by identifying proteins exclusively synthesized during the exposure to stress. Firstly, the high resolution 2-D protein gel electrophoresis technique combined with MALDI-TOF-MS and a DNA array approach were used to investigate the cellular response of S.aureus to heat stress. A switch from normal growth temperature to high temperature condition revealed complex changes in the protein expression pattern as well as the genes expression profile. The effect of puromycin stress on S.aureus cells was analyzed, using a gel-based proteomic approach and transcriptomic analyses with DNA microarrays. We compared the protein synthesis pattern as well as the transcription data of S.aureus in response to puromycin stress with that in response to heat shock. The results demonstrated that both stress conditions induced specific, overlapping and general responses. Finally, the protein expression profile of S.aureus in response to NaCl stress was analyzed with 2D gel based proteomic approach. Our proteome analyses revealed the repression of the synthesis of many enzymes belong to different metabolism pathways . In summary, the signatures for stress or starvation stimuli can be used as diagnostic tools for the prediction of the mode of action of new antibiotics or for studying the physiological state of cells grown. Expression of the respective genes under in vivo conditions could provide some ideas on the environmental signals that specifically influence the survival of S.aureus within and outside the host.
Hintergrund: Wie in vielen anderen Bereichen der Medizin kann ein Methicillin-resistenter Staphylococcus aureus (MRSA) auch zahnmedizinisches Personal sowie ihre Patient*innen besiedeln. Studien zur Prävalenz von MRSA und Methicillin-sensiblem S. aureus (MSSA) bei dieser Berufsgruppe sowie zum Trageverhalten bei persönlicher Schutzausrüstung (PSA) sind jedoch rar.
Ziel: Es wurde eine Beobachtungsstudie (StaphDent Studie) durchgeführt, um die Prävalenz von MRSA und MSSA bei Zahnärzt*innen und zahnärztlichem Personal in der Region Mecklenburg-Vorpommern zu bestimmen. Des Weiteren sollte die Compliance zum Einhalten der Hygienemaßnahmen anhand des Trageverhaltens von PSA ausgewertet werden, um daraus mögliche Rückschlüsse in Bezug auf die Prävalenz von MRSA und MSSA ableiten zu können.
Methoden: Von Zahnärzt*innen (n= 149), zahnärztlichem Personal (n= 297) sowie von weiteren Praxisangestellten wurden zum größten Teil im Selbsttestverfahren Nasenabstriche entnommen. Es erfolgte die Auswertung im Fachbereich Mikrobiologie. Die klonale Verwandtschaft der MSSA-Isolate wurde durch spa-Typisierung und in einigen Fällen durch Ganzgenomsequenzierung charakterisiert. Die Verwendung von PSA wurde anhand eines Fragebogens ermittelt.
Ergebnisse: Während 23,7% (115/485) der Teilnehmenden mit MSSA kolonisiert waren, konnte MRSA in keiner der Proben nachgewiesen werden. Die MSSA-Prävalenz steht in keinem statistischen Zusammenhang mit der Praxisgröße, dem Geschlecht, dem Alter oder der Dauer der Beschäftigung. Die identifizierten 61 spa-Typen ließen sich 17 klonalen Komplexen und vier Sequenztypen zuordnen. Die meisten spa-Typen (n= 51) wurden nur einmal nachgewiesen. In 10 Zahnarztpraxen trat ein spa-Typ zweimal auf. Die Ganzgenomsequenzierung bestätigt eine enge klonale Beziehung für 4/10 dieser Isolatpaare. PSA wurde von den meisten Zahnärzt*innen und ihren Mitarbeitern und Mitarbeiterinnen regelmäßig verwendet.
Schlussfolgerung: Der fehlende Nachweis von MRSA spiegelt die geringere MRSA-Prävalenz in dieser Berufsgruppe wider. Das zum größten Teil konsequente Tragen der PSA und die damit verbundene hohe Compliance bei der Einhaltung der Hygienemaßnahmen scheinen für dieses Ergebnis ursächlich zu sein.
With the development of new functional genomics methods that can access the whole genome, transcriptome, proteome and metabolome more comprehensive insights in cellular processes are possible. Largely based on these advances, our knowledge about molecular constituents for many organisms is increasing at a tremendous rate. Until today, the genomes of several organisms including pathogenic bacteria are already sequenced and pave the way for metabolic network constructions. Interest in metabolomics, the global profiling of metabolites in a cell, tissue or organism, has been rapidly increased. A range of analytical techniques, including nuclear magnetic resonance (NMR) spectroscopy, gas chromatography–mass spectrometry (GC–MS), liquid chromatography–mass spectrometry (LC–MS), Fourier Transform mass spectrometry (FT–MS), high performance liquid chromatography (HPLC) are required in order to maximize the number of metabolites that can be identified in a matrix. With the help of microbial metabolomics (qualification and quantification of a huge variety of metabolites from a bacterium) deciphering of the bacterial metabolism is feasible. The metabolome pipeline or workflow encompasses the processes of (i) sample generation and preparation, (ii) establishment of analytical techniques (iii) collection of analytical data, raw data pre-processing, (iv) data analysis and (v) data integration into biological questions. The present work contributes to the above mentioned steps in a metabolomics workflow. A specific focus was set to the exo- and endometabolome analysis of Gram-positive bacteria
Zielsetzung: Die antimikrobielle Wirksamkeit von kaltem Atmosphärendruckplasma(CAP), auch als gewebeverträgliches Plasma (TTP) bezeichnet,könnte eine aussichtsreiche Option zur Eradikation von Methicillinempfindlichen ebenso wie von Methicillin-resistenten Staphylococcus aureus-Stämmen sein, die oft chronische Wunden kolonisieren. Bisher wurde der Einfluss von CAP auf die Antibiotikaempfindlichkeit von S. aureus kaum untersucht. Da eine Veränderung der Antibiotikaempfindlichkeit für die Wundbehandlung relevant sein könnte, sollte der Einfluss von CAP auf die Empfindlichkeit verschiedener S. aureus-Stämme gegen unterschiedliche Antibiotika untersucht werden.
Methode: Im Agardiffusionstest wurden Antibiotikatestplättchen mit Cefuroxim, Gentamicin, Oxacillin, Vancomycin, Ciprofloxacin, Co-Trimoxazol, Clindamycin und Erythromycin eingesetzt. Die Teststämme wurden auf Agar ausplattiert und mit CAP exponiert, bevor die Testplättchen aufgelegt wurden. Nach 24 h Bebrütung wurden die Inhibitionszonen gemessen und statistisch auf Unterschiede geprüft.
Ergebnisse: In den meisten Fällen war die Einfluss von CAP auf die Antibiotikaempfindlichkeit zu vernachlässigen. Für zwei Stämme wurde die Empfindlichkeit gegenüber β-Lactam-Antibiotika signifikant herabgesetzt.
Schlussfolgerung: Da CAP die Antibiotikaempfindlichkeit beeinflussen kann, sollten vor beabsichtigter kombinierter lokaler CAP-Behandlung und gleichzeitiger systemischer Antibiotikagabe Interaktionen in vitro untersucht werden, um unerwünschte Kombinationseffekte auszuschließen.
Das Ziel dieser Arbeit war die Entwicklung und Etablierung von Methoden zur absoluten und relativen Proteinquantifizierung. In darauf aufbauenden Studien sollten diese Methoden für die Untersuchung physiologisch relevanter Fragestellungen in Bakterien genutzt werden. Zum tieferen Verständnis der Bakterienphysiologie ist es unabdingbar, Mengenänderungen von Proteinen hochaufgelöst darstellen zu können. Relative Proteinquantifizierung erlaubt dabei die Untersuchung von Änderungen der Menge eines Proteins zwischen verschiedenen Proben eines Experiments. Im Rahmen der hier vorgelegten Arbeit wurden 2D PAGE und gelfreie massenspektrometrische Methoden in einer Studie (Tefon et al. 2011, Artikel I) angewendet, um Oberflächen- und Immunoproteine zweier Vakzinationsstämme des humanpathogenen Bakteriums Bordetella pertussis zu charakterisieren. Die relative Proteinquantifizierung erlaubt zwar Rückschlüsse auf die Mengenänderung eines Proteins zwischen verschiedenen Bedingungen, ermöglicht aber nur bedingt Aussagen über die absolute Menge der Proteine. Gerade absolute Proteinmengen und damit Proteinkonzentrationen sind jedoch Grundvoraussetzung für ein zielorientiertes Verwenden der gewonnenen Daten nicht nur im Kontext der Systembiologie. Im Rahmen dieser Arbeit wurde eine Methode entwickelt, in der durch Kombination zweier etablierter Proteomik-Methoden die absolute Quantifizierung für einen großen Teil der cytosolischen Proteine eines Organismus ermöglicht wird. In dieser Methode werden ausgewählte Proteine, deren genaue Konzentration durch gerichtete Massenspektrometrie bestimmt wurde, für die Kalibration von hoch auflösenden 2D Gelen genutzt (Maass et al. 2011, Artikel II). Um das Potential dieses Verfahrens zu verdeutlichen, wurde es für die Analyse der Anpassung von Bacillus subtilis und Staphylococcus aureus an Glukosehunger angewendet. Dabei konnten für 467 Proteine von B. subtilis in drei Zeitpunkten Proteinkonzentrationen bestimmt werden. Für die Etablierung der Methoden waren verschiedene Vorarbeiten nötig: I) Selektion geeigneter Kalibrationsproteine, II) Selektion geeigneter Standardpeptide und Optimierung der massenspektrometrischen Parameter zu deren absoluten Quantifizierung, III) Selektion eines geeigneten, proteinunspezifischen und hoch sensitiven Gelfarbstoffes, IV) Testung verschiedener Zellaufschlussmethoden und Etablierung einer Methode zur Bestimmung der Zellaufschlusseffizienz, V) Testung verschiedener Proteinbestimmungsmethoden zur genauen Bestimmung der Gesamtproteinkonzentration im komplexen cytosolischen Extrakt und VI) Optimierung der vollständigen enzymatischen Spaltung aller Proteine vor der massenspektrometrischen Analyse. Im Rahmen dieser Arbeit konnte außerdem gezeigt werden, dass sich die Kalibration der 2D Gele für die Ermittlung absoluter Daten zwischen Gelen übertragen lässt, was den Aufwand für große Zeitreihenexperimente deutlich reduziert. Die Genauigkeit und der dynamische Bereich 2D-gelbasierter relativer und absoluter Proteinquantifizierung kann durch eine erhöhte Reproduzierbarkeit, Auflösung und Sensitivität der Gele verbessert werden. Die Etablierung von HPE-Gelen führte zu 25 % mehr detektierbaren und damit quantifizierbaren Proteinspots und Proteinen bei deutlich erhöhter Reproduzierbarkeit (Moche et al. 2013, Artikel III). Die zusätzlich höhere Anzahl von Gelen mit quantifizierbarer Qualität verringert außerdem den Zeit- und Kostenaufwand vor allem für komplexe experimentelle Ansätze. Die neue Methode zur gelbasierten absoluten Proteinquantifizierung wurde in einer Folgestudie angewendet, um die Konzentrationen von mehr als 700 Proteinen von B. subtilis während der physiologisch relevanten Anpassung an verschiedene Stressbedingungen, nämlich Glukosehunger und Hitzestress, zu bestimmen (Maaß et al. 2014, Artikel IV). Der Vergleich der beiden Stressbedingungen ermöglicht eine Unterscheidung der generellen von der spezifischen Stressantwort, wobei die Analyse der Daten durch Berechnung der Proteinkosten und der Ressourcenverteilung auf verschiedene metabolische Pfade und regulatorische Einheiten unterstützt wurde. Da die Nutzung von 2D PAGE zur Proteinquantifizierung auf im Gel detektierbare Proteine beschränkt ist, ist es für eine höhere Proteomabdeckung sinnvoll, gelbasierte Methoden mit gelfreien Methoden zu ergänzen. Deshalb wurde eine Methode zur labelfreien MS-basierten absoluten Quantifizierung von Proteinen im großen Maßstab entwickelt und etabliert. In dieser gel- und labelfreien Quantifizierungstechnik wurde datenunabhängige, parallele Fragmentierung aller zeitgleich eluierenden Vorläufermoleküle (LC-MSE) genutzt. Auch für diese Methode der absoluten Proteinquantifizierung bildeten die im Rahmen dieser Arbeit entwickelten Probenaufbereitungsverfahren die Grundlage (Muntel et al. 2014, Artikel V).
Staphylococcus aureus (S. aureus) endocarditis is still one of the most fatal heart diseases, with a mortality rate of 20-45%. In recent years, the importance of endothelial cells (ECs) in the context of endocarditis has become more evident. The vascular endothelium forms a selective barrier between blood and the adjacent tissue by maintaining an anti-inflammatory and anti-thrombogenic phenotype. However, in case of insertion of cardiac implants, an injury of the endothelium can occur which promotes platelet aggregation followed by S. aureus adherence to the platelets, especially in areas with low hemodynamic shear stress. This process is considered as a key event in the development of infective endocarditis (IE) and allows bacteria to colonize the heart valves. Despite extensive research, the pathogenesis of IE is still not completely understood. Therefore, further investigations are needed to enable an effective prevention of this life-threatening disease.
In order to study the infection process of S. aureus, internalization experiments with two different S. aureus strains, one control strain (HG001) and one strain isolated from an endocarditis patient (T-72949) were performed in human coronary artery endothelial cells (HCAEC). Subsequently, an extensive proteome analysis of the host cells was carried out. More specific analyses were performed using peptidoglycan (PGN), a cell wall component of Gram-positive bacteria, which causes a pro-inflammatory response in ECs. In this context, the focus remained on the analysis of cellular changes in terms of cell stiffness, wound healing, and additionally platelet aggregation.
The analysis of the HCAEC host proteome revealed a time-related difference depending on the infecting bacterial strain. Several proteins involved in host cell signaling pathways exhibited a higher abundance at earlier time points in host cells infected with endocarditis strain T-72949 compared to those infected with HG001. Further proteome analysis uncovered several adaptations on the cellular side that enable internalization and replication of both S. aureus strains as well as the activation of pathways that promote cellular recovery. Furthermore, it could be shown that PGN reduced cellular stiffness which could lead to an increased bacterial uptake and would thereby promote the development of a chronic S. aureus infection. Additionally, PGN prevented effective wound healing which promotes a pro-thrombotic and pro-inflammatory condition. This status could facilitate the bacterial infection of further cells. Apart from that, PGN induced platelet aggregation which could ease bacterial adhesion to thrombotic surfaces (e.g., dysfunctional endothelium). The following formation of a mature vegetation might protect the bacteria from the immune system and antibiotics.
The results of the present work emphasize the central role of ECs in the context of IE. It could be demonstrated that a healthy monolayer of ECs enables a beneficial cell response and may prevent the development of vascular diseases. Moreover, the comprehensive proteome dataset which was generated in this project provides a valuable source of information for future studies to unravel further molecular mechanisms of endocarditis and possible therapeutic approaches.
Metabolomics is the scientific study of metabolites of an organism, cell, or tissue. Metabolomics makes use of different analytical approaches. In this thesis, an analytical platform consisting of proton nuclear magnetic resonance spectroscopy (1H-NMR), gas chromatography-mass spectrometry (GC-MS, EI/quadrupol) and liquid chromatography-mass spectrometry (LC-MS, ESI/TOF) was used for metabolite analysis. Due to the high physicochemical diversity of metabolites, the usage of different analytics is profitable. Focusing on metabolome analysis of microorganisms, the development of viable protocols was prerequisite. To ensure metabolome samples of best possible quality, particularly the sampling procedure has to be optimized for each microorganism to be analyzed individually. In microbial metabolomics, the energy charge value is a commonly used parameter to assure high sample quality (Atkinson 1968). The pathogenic bacterium Staphylococcus aureus and the biotechnical relevant bacterium Bacillus subtilis were main target of research. The sampling protocol development “A protocol for the investigation of the intracellular Staphylococcus aureus metabolome” (Meyer et al. 2010) and “Methodological approaches to help unravel the intracellular metabolome of Bacillus subtilis”s (Meyer et al. 2013) confirmed the need for development and verification of viable protocols. It was observed, that minor differences in the sampling procedure can cause major differences in sample quality. Using the validated analytical platform and the optimized protocols, we were able to investigate the metabolome of S. aureus and B. subtilis under different conditions. Investigations of the pathogenic bacterium S. aureus are of major interest due to its increasing resistance to antibiotics. Methicillin (multi)-resistant S. aureus (MRSA) strains are responsible for several difficult-to-treat infections. The cell wall of bacteria is the target of an array of antibiotics, like the beta-lactam antibiotics. Our study “A metabolomic view of Staphylococcus aureus and Its Ser/Thr kinase and phosphatase deletion mutants: Involvement in cell wall biosynthesis” (Liebeke et al. 2010) revealed the influence of the serine-threonine kinase on cell wall biosynthesis of S. aureus. LC-MS based metabolome data uncovered prevalent wall teichoic acid precursors in the serine-threonine kinase deletion mutant (ΔpknB), and predominantly peptidoglycan precursors in the phosphatase deletion mutant (Δstp), compared to the S. aureus wild type strain 8325. This uncovered a so far undescribed importance of the serine-threonine kinase on the cell wall metabolism and provides new insights into its regulation. The nasopharynx and the human skin are often the ecological niche of S. aureus. Furthermore, S. aureus exists outside its host, for example on catheters. Depending on its niche, S. aureus is exposed to several stress factors and limitation conditions, such as carbon source limitation and starvation. To cope with the latter, a number of regulatory cellular processes take place. In “Life and death of proteins: a case study of glucose-starved Staphylococcus aureus” (Michalik et al. 2012) protein degradation during glucose starvation was monitored. An intriguing observation was that proteins involved in branch chain amino acid biosynthesis and purine nucleotide biosynthesis were distinctly down-regulated in the clpP mutant. This lead to the assumption of a stronger repression of CodY-dependent genes in the clpP mutant. Intracellular metabolome data revealed higher GTP concentrations in the clpP mutant. This may explain the higher CodY activity and thereby stronger repression of CodY-dependent genes in the clpP mutant. Since different S. aureus strains are known to colonize different niches, global carbon source (glucose, glucose 6-phosphate, glycerol, lactate, lactose and a mixture of all) and carbon source limitation dependent exo-metabolome analyses were performed using three different S. aureus strains (HG001: laboratory strain, EN493: human endocarditis isolate and RF122: bovine mastitis strain). The most apparent observation was that RF122 can utilize lactose best, while EN493 and HG001 are better at utilizing glucose-6-phosphate compared to the bovine RF122 strain. Bacillus subtilis is an extensively studied Gram-positive and non-pathogenic bacterium. In the functional genomics approach “System-wide temporal proteomics profiling in glucose-starved Bacillus subtilis” (Otto et al. 2010) growth phase dependent changes in the proteome, transcriptome and extracellular metabolome were monitored. By mass spectrometric analysis of five different cellular subfractions, ~ 52% of the predicted proteins could be identified. To confirm and complete the proteomic data transcriptome and extracellular metabolome analyses were performed. The extracellular metabolome data ensured that cells were glucose-starved and revealed growth phase dependent metabolic footprints. In “A time resolved metabolomics study: The influence of different carbon sources during growth and starvation of Bacillus subtilis” ((Meyer et al. 2013) submitted) four different compounded cultivation media were investigated as only glucose, glucose and malate, glucose and fumarate and glucose and citrate as carbon source. It could be shown, that B. subtilis is able to maintain an intracellular metabolite homeostasis independent of the available carbon source. On the other hand, in the exo-metabolome, carbon source as well as growth phase dependent differences were detected. Furthermore, in this study the influence of ATP and GTP on the activation of the alternative RNA polymerase sigma factor B (σB) was discussed. The concentration of ATP and GTP decreased for all conditions, as cells entered the stationary growth phase. While cell growth on solely glucose and during growth on glucose and additional malate, the ATP and GTP concentrations increased slightly when the consumption of the second carbon source was initiated. Only under these conditions, a considerable σB activity increase during the transition from exponential to stationary growth phase was observed. Furthermore, the developed sampling protocol for metabolome analysis of B. subtilis enabled us to be part of a “multi omics” system biological approach to study the physiological adjustment of B. subtilis to cope with osmotic stress under chemostat conditions.
Proteolysis represents the final step in the life of a protein. It is one of the most important cellular processes assisted by chaperone systems and ensures an appropriate protein homeostasis. Protein degradation is essential for the removal of cytotoxic protein aggregates and mis-translated/mal-folded proteins, „unemployed“ and regulatory proteins to enable rapid cell adaptation to altering environmental conditions (Gottesman, 2003; Wiegert & Schumann, 2001; Parker, 1981; Stansfield et al., 1998; Drummond & Wilke, 2008; Goldberg, 1972; Gerth et al., 2008). The bacterial Clp (caseinolytic proteins) protease complexes are analogous to the eukaryotic 26S proteasome and consist of Hsp100/Clp proteins of the AAA+ superfamily and an associated barrel-like proteolytic chamber (e.g. ClpP). The Clp proteases seem to be responsible for the major protein turnover in low GC, Gram+ bacteria. The main goal of this thesis was to develop new methods and tools to investigate global proteolysis more precisely and to get a detailed understanding of protein degradation during starvation conditions and it´s regulation in low GC, Gram-positive bacteria. To analyse protein degradation under starvation conditions the well established glucose starvation model was used. In Bacillus subtilis it could be shown that approximately 200 proteins are selectively degraded in a glucose depletion induced stationary phase. Furthermore radioactive pulse-chase labelling experiments coupled with 2D-PAGE analysis revealed that mainly the ClpCP protease complex is involved in the degradation of proteins in the stationary growth phase. To investigate proteolysis in the human pathogen Staphylococcus aureus in the same way, a newly developed chemically defined medium was established suitable for radioactive pulse-chase labelling experiments under stable glucose starvation conditions. The degradation kinetics of individual 2D spots was significantly better resolved using 14C-BSA as an internal marker protein for the sample normalisation. A rather huge overlap was found within the functional protein classes that were degraded in B. subtilis and S. aureus the stationary phase. Among others, especially proteins involved in amino acid, nucleotide and cell wall biosynthesis were rapidly degraded, whereby not always the same and sometimes another enzymes from a biosynthetic chain were targeted for proteolysis. Despite the resolution power of the 2D-PAGE method, there are some drawbacks such as a limited "protein window" with regard to the molecular weight and isoelectric point, loss of low abundance proteins and a rather low reproducibility for time course experiments. Therefore a mass spectrometry based approach for the simultaneous detection of protein synthesis, accumulation and degradation was developed. This pulse-chase SILAC approach provides a very good reliability with a broad spectrum of proteins that can be analysed. Through the combination with ultracentrifugation even non-soluble and aggregated proteins could be analysed. Several hundred proteins were degraded in S. aureus during glucose starvation. Among them was the functional cluster of ribosomal proteins which is degraded in the early stationary phase. Furthermore proteins belonging to complexes were degraded with the same kinetic (e.g. NrdE, NrdF). In addition selective protein degradation took place according to functional categories (e.g., ribosomal proteins, biosynthetic, glycolytic enzymes) and not to regulatory groups (e.g. CcpA, SigB regulon).The investigation of a clpP deletion mutant in S. aureus revealed a greater susceptibility to aggregation, where the cells try to counteract with the expression of chaperones like GroEL/ES, ClpB and DnaK. The renaturation process is very ATP consuming and only takes place in energy rich phases of growth (e.g. from exponential to transient growth phase). Protein aggregation was found enhanced in the stationary phase. Furthermore, a higher GTP level compared to the wild-type probably resulted in a stronger CodY mediated repression with a rather low level of amino acids in clpP mutant cell. In addition substances like glycerol, which thermodynamically stabilise proteins in refolding processes (Maeda et al., 1996; Feng & Yan, 2008), were found in higher levels compared to the wild-type. A strong response to reactive oxygen species was detected in the clpP mutant strain, which is probably due to ROS production during the early stages of protein aggregation. Altogether, different methods were used for investigation protein degradation at a proteome-wide scale. Hundreds of degradation candidates were identified by gel-based and gel-free approaches in S. aureus wild-type cells. “Unemployed” proteins (e.g. ribosomal proteins, biosynthetic enzymes) were degraded and proteins particularly required and synthesized in glucose-starved cells such as TCA cycle enzymes were stable in the stationary phase. Investigation of the clpP mutant strain supports a proposed model for the pleiotropic phenotype and provides a deeper insight in the fine-tuned protein quality control and the important role of ClpP during starving conditions.
A method employing labeling of cell-surface proteins with Sulfo-NHS-SS-biotin and subsequent affinity enrichment with NeutrAvidin has been optimized in order to make cell-surface proteins from Gram-positive bacteria reliably accessible to quantitative mass spectrometric analyses. The optimized biotinylation approach was applied for analysis of the lipoproteome from S. aureus and S. pneumoniae on a global scale and the influence of mutations in the lipoprotein maturation pathway on the cell-surface and exoproteomes of both species was investigated. The biotinylation approach was integrated into a proteomic workflow that employs metabolic labeling with heavy nitrogen for relative protein quantification to investigate proteomic differences between S. aureus in a biofilm model and its free-floating, planktonic counterparts.
Staphylococcus aureus(S. aureus) is a pathobiont of humans as well as a multitude of animalspecies. The high prevalence of multi-resistant and more virulent strains ofS. aureusnecessitatesthe development of new prevention and treatment strategies forS. aureusinfection. Major advancestowards understanding the pathogenesis ofS. aureusdiseases have been made using conventionalmouse models, i.e., by infecting naïve laboratory mice with human-adaptedS. aureusstrains. However,the failure to transfer certain results obtained in these murine systems to humans highlights thelimitations of such models. Indeed, numerousS. aureusvaccine candidates showed promising resultsin conventional mouse models but failed to offer protection in human clinical trials. These limitationsarise not only from the widely discussed physiological differences between mice and humans, but alsofrom the lack of attention that is paid to the specific interactions ofS. aureuswith its respectivehost. For instance, animal-derivedS. aureuslineages show a high degree of host tropism and carry arepertoire of host-specific virulence and immune evasion factors. Mouse-adaptedS. aureusstrains,humanized mice, and microbiome-optimized mice are promising approaches to overcome theselimitations and could improve transferability of animal experiments to human trials in the future.
Das Gram-positive Bakterium S. aureus besiedelt rund 20 % der Menschen persistent und asymptomatisch, während sich bei den anderen Phasen der Kolonisation und Nicht-Kolonisation abwechseln. Als opportunistisches Pathogen kann S. aureus seinen Wirt auch infizieren und eine Vielzahl von Krankheitsbildern hervorrufen. Diese reichen von oberflächlichen Haut- und Weichteilinfektionen bis hin zu komplexen Infektionsgeschehen wie der Sepsis und können den Tod der betroffenen Person zur Folge haben. Antibiotika-resistente Varianten wie Methicillin-resistente S. aureus (MRSA) verkomplizieren die Therapie und sind als „Krankenhauskeime“ gefürchtet. Die Kolonisierung und Infektion mit MRSA beschränkt sich allerdings nicht nur auf Gesundheitseinrichtungen, sondern etablierte sich auch in der Allgemeinbevölkerung sowie in Landwirtschaftsbetrieben. Da S. aureus neben dem Menschen ebenfalls eine Vielzahl von Wild- und Nutztieren kolonisieren und infizieren kann, welche als Reservoir, Überträger sowie als Brutstätten neuer Varianten fungieren, ist ein holistischer Ansatz wie das „One Health“-Konzept gefordert, um Ausbreitung und Infektionen unter Kontrolle zu halten.
Dies erfordert geeignete Tiermodelle, um die komplexen Interaktionen von S. aureus mit seinem Wirt zu analysieren und therapeutisch zu beeinflussen. Am häufigsten werden dafür etablierte Labormaus-Stämme (z.B. C57BL/6, BALB/c) eingesetzt und mit S. aureus-Stämmen des Menschen kolonisiert oder infiziert. Weil S. aureus jedoch einen Wirtstropismus ausbildet, ist die Aussagekraft solcher Mausmodelle durch die Inkompatibilität zwischen Erreger und Wirt limitiert. Manche Aspekte der Wirt-Pathogen-Interaktion lassen sich in diesen Modellen gar nicht untersuchen. Hier könnten murin-adaptierte S. aureus-Stämme eine bessere Option sein, zumal Vorarbeiten unserer Arbeitsgruppe zeigten, dass Mäuse natürliche Wirte von S. aureus sind.
In dieser Arbeit sollte daher untersucht werden, ob Befunde aus dem Menschen in der Maus repliziert werden können, wo die Limitationen von Mausmodellen liegen und wie mögliche Optimierungsansätze aussehen könnten. Weitere Schwerpunkte lagen auf Analysen der Populationsstruktur von S. aureus in murinen Spezies unterschiedlicher Habitate und der Adaptation muriner S. aureus-Isolate an ihren Wirt. Außerdem wurden Maus-adaptierte Stämme in Infektions- und Kolonisationsmodellen eingesetzt, um ihre Eignung im Mausmodell zu testen.
In einer Originalarbeit (Mrochen et al.; Front. Immunol.; 2021) haben wir anhand der Immunantwort auf die beiden S. aureus-Virulenzfaktoren SplB und GlpQ beschrieben, dass Daten aus klinischen Studien in der Maus rekapituliert werden können. S. aureus-naive Mäuse zeigten nach Vakzinierung mit SplB eine sehr ähnliche Polarität der Immunantwort wie Menschen nach natürlicher Besiedlung/Infektion mit S. aureus. Mäuse reagierten mit einer Th2-Antwort auf das nicht-adjuvantierte Protein SplB, zudem war die Anzahl an Eosinophilen in der Milz signifikant erhöht. Im Serum der Mäuse ließ sich SplB-spezifisches IgE messen. Damit spiegelte das Mausmodell den beim Menschen bekannten Typ2-Bias der Immunreaktion auf Spls von S. aureus wider. GlpQ löste hingegen ohne Adjuvans keine messbare Immunreaktion aus, hatte also eine geringe Immunogenität. Dies zeigt, dass S. aureus-naive Mäuse sich dazu eignen könnten, die intrinsische Immunogenität und das Immunpolarisationspotential von S. aureus-Proteinen zu untersuchen, was für die Entwicklung von S. aureus-Vakzinen von Bedeutung ist.
In einem Übersichtsartikel (Mrochen et al.; Int. J. Mol. Sci.; 2020) haben wir die Limitationen von konventionellen S. aureus-Infektionsmodellen, bei denen Mäuse mit human-adaptierten S. aureus-Isolaten infiziert werden, veranschaulicht und Alternativen aufgezeigt. Zunächst stellten wir den Wirtstropismus von S. aureus und Mechanismen der Wirtsanpassung dar. Darauf aufbauend diskutierten wir einige Limitationen konventioneller Mausmodelle. Wir betrachteten Aspekte der genetischen Variation der verwendeten Maus- und S. aureus-Stämme, wirtsspezifische Virulenzfaktoren, Unterschiede des humanen und murinen Immunsystems, den Einfluss des murinen Mikrobioms und der verwendeten Infektionsdosen. Zusammenfassend kann dazu gesagt werden, dass durch die Inkompatibilitäten zwischen humanen S. aureus-Isolaten und der Maus die bakterielle Fitness und Virulenz eingeschränkt ist. Dies kann die Aussagekraft von Experimenten massiv einschränken. Beispielsweise können in ihrer Affinität verminderte Rezeptor-Ligand-Interaktionen die Akquisition von Nährstoffen erschweren und die Wirkungslosigkeit bestimmter Virulenzfaktoren (wie z.B. Superantigenen) die Immunevasion behindern. Wir haben daraufhin alternative Modell-Ansätze vorgestellt und diskutiert, welche unterschiedliche Aspekte der Wirt-S. aureus-Interaktion verbessern sollen (humanisierte Mäuse, dirty mice, Wildlinge). Die ebenfalls mögliche Verwendung murin-adaptierter S. aureus-Stämme beseitigt Inkompatibilitäten zwischen Maus und S. aureus komplett, kann aber manche humanspezifischen Vorgänge nicht modellieren.
In zwei weiteren Originalarbeiten (Mrochen et al.; Int. J. Med. Microbiol.; 2018 und Raafat et al.; Toxins; 2020) haben wir die Populationsstruktur von S. aureus in Labormäusen bzw. Ratten unterschiedlicher Habitate (Labor, Wildnis) beschrieben und die Adaptation der Bakterien an diese Wirte dargestellt. Rund um den Globus sind Labormäuse mit S. aureus besiedelt. Einige murine Isolate gehörten zu klonalen Komplexen wie CC1, CC5, CC8 und CC15, die sich auch beim Menschen finden, sodass hier eine Übertragung vom Menschen auf die Maus wahrscheinlich ist. Dennoch zeigten viele der Isolate eindeutige Zeichen einer Wirtsadaptation. So waren humanspezifische Virulenzfaktoren seltener als bei humanen Referenzisolaten gleicher Linien vorhanden. 47 % der Isolate gehörten jedoch zum klonalen Komplex CC88, der selten beim Menschen ist. Diese Linie war in Vorarbeiten unserer Arbeitsgruppe bereits als murin-adaptiert identifiziert worden, was sich hier bestätigte.
Bei Laborratten zeigte sich ein ähnliches Bild. Auch hier wurden viele Stämme isoliert, die zu typisch humanen Linien (z.B. CC1, CC8, CC15) gehören, außerdem CC88-Isolate. Sie zeigten Zeichen einer Adaptation an Ratten. S. aureus-Isolate aus Wildratten und aus von Wildratten abstammenden Ratten in Gefangenschaft besaßen eine vollkommen andere Populationsstruktur. Hier fanden sich u.a. Linien (CC49, CC130, ST890), die wir in einer anderen Studie aus Wildmäusen isoliert haben. Auch sie wiesen die Zeichen einer Wirtsadaptation auf.
Diese Studien zeigen, dass die Besiedlung von Labormäusen und -ratten durch S. aureus weit verbreitet ist und vermutlich meist vom Menschen ausgeht. Dennoch weisen die Laborstämme Anzeichen einer Adaptation an die Nager auf, was eine längere Kontaktzeit voraussetzt, die diese evolutionären Vorgänge ermöglicht. Die Besiedlung der Labortiere hat zudem Folgen für die Konstitution des Immunsystems, da es auf dieses Bakterium geprimt wird. Weiterhin kann eine Besiedlung zu opportunistischen Infektionen führen. Folglich sollte bei Experimenten stets der S. aureus-Besiedlungsstatus erfasst werden, um einen etwaigen Einfluss auf die erzielten Ergebnisse ausschließen bzw. nachweisen zu können. Bei Wildnagern und ihren Verwandten weist S. aureus eine andere Populationsstruktur auf, welche über einen gewissen Zeitraum auch in Gefangenschaft stabil zu sein scheint. Wildtiere sind damit ein bedeutendes Reservoir und potentielle Überträger von S. aureus, aber ebenfalls eine Quelle neuer Stämme, die zu Forschungszwecken eingesetzt werden könnten.
In zwei weiteren Originalarbeiten (Trübe et al.; Int. J. Med. Microbiol.; 2019 und Fernandes et al.; Microorganisms; 2021) haben wir die Eignung verschiedener murin-adaptierter Stämme in Infektions- und Kolonisationsmodellen diskutiert. S. aureus-Isolate aus Wild- und Labormäusen wurden in BALB/c-Mäusen mit dem humanen Stamm Newman verglichen. Ein CC49-Isolat (S. aureus DIP), das aus Rötel- und Gelbhalsmäusen stammte, erwies sich als besonders virulent und provozierte selbst in einer im Vergleich mit dem Stamm Newman zehnfach geringeren Infektionsdosis vergleichbare Symptome und Immunreaktionen. Die geringere Infektionsdosis ist wahrscheinlich klinisch relevanter, da pathophysiologische Eigenschaften von S. aureus auch dichteabhängig reguliert werden (quorum sensing).
In einem Kolonisationsmodell mit dem murin-adaptierten Laborstamm JSNZ wurde die dekolonisierende Wirkung von Aurintricarbonsäure (ATA) evaluiert. ATA war zuvor in breit angelegten in vitro-Screenings als potenter Adhäsionsinhibitor identifiziert worden. C57BL/6-Mäuse wurden mit JSNZ kolonisiert und anschließend mit ATA behandelt. Leider war ATA im Mausmodell wirkungslos, während mit der in der Klinik eingesetzten Kontrollsubstanz Mupirocin eine vollständige Dekolonisation erreicht werden konnte. JSNZ bestätigte sich jedoch als persistierender Besiedler der Maus. Dieses Besiedlungsmodell ist daher sehr gut geeignet, um neue Agenzien für eine S. aureus-Dekolonisierung zu testen oder die Wirt-Pathogen-Interaktion bei der Kolonisation im Detail zu analysieren.
Die Ergebnisse dieser Arbeit zeigen, dass sich Mausmodelle besser für die Forschung an S. aureus eignen als bisher angenommen. Trotzdem muss die Übertragbarkeit der Ergebnisse auf den Menschen stets kritisch überprüft werden. Die Maus-adaptierten S. aureus-Stämme sind ein neues und potentes Werkzeug, die S. aureus-Forschung zu optimieren. Von besonderem Interesse ist die Möglichkeit, Mäuse persistent zu kolonisieren, wie dies typisch für die Interaktion von S. aureus mit seinem menschlichen Wirt ist. Diese wichtige Facette im Zusammenspiel zwischen dem Erreger und seinem Wirt wird nun erstmals der experimentellen Forschung zugänglich.
Das alpha-Toxin (Hla) von Staphylococcus aureus (S. aureus) spielt eine bedeutende Rolle bei S. aureus-induzierten Pneumonien. Hla bindet zunächst als Monomer an die Plasmamembran eukaryotischer Wirtszellen und assoziiert sich zu heptameren Transmembranporen. Die Sensitivität gegenüber dem Toxin ist bei verschiedenen Atemwegsepithelzelllinien unterschiedlich ausgeprägt. Die Gründe dafür sind bis jetzt nicht vollends verstanden. Mögliche Faktoren, die einen Einfluss auf die Hla-Sensitivität der Zellen haben, könnten die Rezeptordichte und Effizienz der Porenbildung sowie die Entsorgung von Poren aus der PM durch Internalisierung und Degradation (lysosomal, proteasomal) oder durch Ausschleusung von extrazellulären Vesikeln in den Extrazellularraum sein.
Ziel dieser Arbeit war es, die Bedeutung der Faktoren, die einen Einfluss auf die Toxin-Sensitivität von Wirtszellen haben könnten, am Beispiel der drei Atemwegs-Modellzelllinien 16HBE14o-, S9 sowie A549 genauer zu untersuchen.
Dabei konnte gezeigt werden, dass die Menge an rHla, allem voran die Abundanz der Heptamere in der Plasmamembran der Zellen, einen starken Einfluss auf die Toxinsensitivität (gemessen an der Rate parazellulärer Lückenbildung in den Zellverbänden) der Zelllinien hat. Diese Ergebnisse korrelierten am besten mit der Häufigkeit des potenziellen Hla-Rezeptors ADAM10 in der Plasmamembran der drei Zelltypen, aber auch das Phospholipid Sphingomyelin scheint ebenfalls einen Einfluss auf die Hla-Sensitivität der Zellen zu haben. Die Zellgröße, der für die Hla-Vorpore stabilisierende Faktor Caveolin-1, Integrin α5β1 als weiterer möglicher Hla-Rezeptor und die Lipide Phosphatidylcholin/-serin zeigten dagegen keine Korrelation zur Hla-Sensitivität der drei Atemwegsepithelzelllinien. Das Lipid Phosphatidylethanolamin wies zwar das gleiche Muster wie das des Sphingomyelins bei den Zelllinien auf, jedoch muss eine mögliche Bedeutung des Lipids in der Hla-Bindung und/oder -Heptamerisierung erst noch untersucht werden.
Untersuchungen der Internalisierung des Toxins zeigten, dass von den drei Atemwegsepithelzelllinien nur die S9-Zellen in der Lage waren die rHla-Heptamere effizient zu internalisieren. Dabei konnte unter Verwendung der rHla-Mutante rH35L, die keine Transmembranpore ausbilden kann, gezeigt werden, dass die Internalisierung der Toxin-Heptamere wahrscheinlich Poren-unabhängig geschieht. Durch die Überprüfung des rHla-Abbaus in S9-Zellen nach Inhibierung der lysosomalen oder proteasomalen Proteindegradation konnte ein Abbau des Toxins über das Proteasom ausgeschlossen werden. Dagegen scheint der lysosomale Weg von entscheidender Bedeutung für die Hla-Heptamer-Degradation zu sein. Eine saure Hydrolyse der Protease-resistenten Toxin-Heptamere in rHla-Monomere konnte allerdings nicht nachgewiesen werden und scheint somit bei dem lysosomalen Abbau keine Rolle zu spielen. Präparierte extrazelluläre Vesikel von rHla-behandelten S9-Zellen zeigten zudem, dass eine Entsorgung des Toxins über Exosomen und/oder Mikrovesikel ebenfalls bei diesen Zellen möglich zu sein scheint. Der primäre Weg der Hla-Prozessierung ist bei den S9-Zellen dennoch der lysosomale Abbau.
Selbst bei intensiv erforschten Modellorganismen ist die Funktion von mindestens einem Drittel der codierten Proteine bis heute vollkommen unbekannt. Dies trifft auch auf das Gram-positive, fakultativ pathogene Bakterium Staphylococcus aureus zu. Mit 25.000 Molekülen pro Zelle ist das alkalische Schock Protein Asp23 eines der abundantesten Proteine in S. aureus. Abgesehen davon, dass die Expression von asp23 unter alkalischen Schock Bedingungen induziert ist, weshalb es seinen Namen erhielt, und dass es alleinig σB-abhängig transkribiert wird und somit gut als Marker für σB-Aktivität geeignet ist, war über Asp23 zu Beginn dieser Arbeit nichts bekannt. Das asp23-Gen liegt in einem tetracistronischen Operon. Bestandteil dieses Operons sind außerdem opuD2, das für einen Transporter für Osmoprotektantien codiert, und SAOUHSC_02442 und SAOUHSC_02443, die beide für Membranproteine unbekannter Funktion codieren. Interessanterweise enthalten sowohl Asp23 als auch SAOUHSC_02443 eine DUF322-Domäne. DUF322-Domänen sind in Gram-positiven Bakterien sehr konserviert und kommen normalerweise in mehreren Kopien pro Genom vor. Fluoreszenzmikroskopische Untersuchungen zeigten, dass das cytoplasmatische Protein Asp23 nahe der Membran lokalisiert ist. Dabei konnte Asp23 entlang der gesamten Membran nachgewiesen werden. Auffällig war jedoch, dass in sich teilenden Zellen die Stellen frei von Asp23 blieben, wo sich das neue Septum gebildet hat. Nur in Zellen, die sich vermutlich in einem fortgeschrittenen Stadium der Zellteilung befanden, konnte auch am Septum Asp23 nachgewiesen werden. Da für Asp23 selbst keine Transmembrandomänen vorhergesagt werden, wurde untersucht, ob eines der im asp23-Operon codierten Membranproteine an der Verankerung von Asp23 an der Membran beteiligt ist. Dazu wurden Deletionsmutanten der drei Gene opuD2, SAOUHSC_02443 und SAOUHSC_02442 konstruiert und die Lokalisation von Asp23 in diesen Mutanten fluoreszenzmikroskopisch untersucht. Ein eindeutiger Einfluss auf die Lokalisation von Asp23 konnte nur für die Deletion von SAOUHSC_02443 nachgewiesen werden. Mittels BACTH-Analyse konnte außerdem eine direkte Interaktion zwischen SAOUHSC_02443 und Asp23 gezeigt werden. SAOUHSC_02443 ist somit maßgeblich an der Verankerung von Asp23 an der Membran beteiligt und wurde deshalb als „Asp23 membrane anchoring protein“, kurz AmaP, benannt. Mithilfe des BACTH-Systems wurden zudem alle theoretisch möglichen Interaktionen zwischen den im asp23-Operon codierten Proteinen untersucht. Dabei konnten Selbstinteraktionen von allen vier Proteinen, OpuD2, AmaP, SAOUHSC_02442 und Asp23, nachgewiesen werden und eine Interaktion zwischen SAOUHSC_02442 und der Membrandomäne von AmaP. Die Selbstinteraktion von AmaP wird über dessen Membrandomäne vermittelt. Für die Selbstinteraktion von Asp23 ist hingegen dessen DUF322-Domäne in Kombination mit dem C-Terminus wichtig. Die Interaktion zwischen Asp23 und AmaP konnte nur dann nachgewiesen werden, wenn AmaP intakt war, was dafür spricht, dass AmaP eine von seinem Membranteil abhängige Quartärstruktur einnehmen muss, um die Bindungsstelle für Asp23 zu bilden. Da neben der mittels BACTH-Analyse gezeigten Selbstinteraktion von Asp23 auch Ergebnisse von Gelfiltrationsexperimenten dafür sprachen, dass Asp23 polymere Strukturen ausbildet, wurde Asp23 mit einem Strep-tag in Escherichia coli exprimiert, gereinigt und mittels Elektronenmikroskopie visualisiert. So konnte gezeigt werden, dass Asp23 in vitro spiralig gewundene, bis zu mehrere Mikrometer lange Filamente bildet. Im Zuge einer strukturellen Charakterisierung der Filamente wurden drei Punktmutationen in Asp23 identifiziert (K51A, E106A, K117A), die die Filamentbildung in vitro beeinträchtigten. In einer vergleichenden Transkriptionsanalyse der asp23-Deletionsmutante und des Wildtyps konnten 16 in der asp23-Mutante hochregulierte Gene identifiziert werden. Darunter waren viele Gene, die zum Vancomycin-Stimulon gehören. Mittels Northern Blot konnte das Ergebnis der DNA-Microarray-Analysen bestätigt werden. Zudem konnte so gezeigt werden, dass die in der asp23-Mutante hochregulierten Gene auch in der amaP-Mutante hochreguliert sind, in der Asp23 vorhanden, aber delokalisiert ist. Die phänotypische Charakterisierung deutet somit ebenso wie die Lokalisation von Asp23 auf eine Zellwand-assoziierte Funktion hin.
Staphylococcus aureus ist ein Gram-positives pathogenes Bakterium, welches bei ca. 30 % der gesunden Bevölkerung zur kommensalen Flora der Nasenschleimhaut gehört. Jedoch zählt S. aureus auch zu den häufigsten Erregern bakterieller Infektionen beim Menschen. Aus diesem Grund wurden S. aureus-Stämme in zahlreichen Studien untersucht, um die Pathophysiologie und Virulenz der Bakterien sowie die zugrundeliegenden Regulationsmechanismen zu verstehen. Die Expression von Virulenzfaktoren wird direkt oder indirekt durch verschiedene Regulatoren beeinflusst. Zu diesen zählen beispielsweise das Quorum-Sensing-System Agr, der alternative Sigma-Faktor SigB und das Zweikomponentensystem SaeRS. Bei der Regulation der Genexpression spielt neben Mechanismen, die die Transkriptionsinitiation beeinflussen, auch die Transkriptions-termination eine Rolle. Bei Bakterien unterscheidet man zwischen der Rho-unabhängigen und der Rho-abhängigen Transkriptionstermination. In bisherigen Studien wurde die Rolle des Transkriptionsterminationsfaktors Rho in Escherichia coli, Bacillus subtilis und Mycobacterium tuberculosis untersucht. Hierzu zählt unter anderem das Silencing von horizontal erworbenen Genen, die Verhinderung von DNA-Doppelstrangbrüchen und die Unterdrückung der persistierenden Antisense-Transkripten. Besonders die erhöhte Antisense-Transkription konnte auch in einer Tiling Array-Studie des S. aureus Wildtypstammes HG001 und einer isogenen Δrho-Mutante ST1258 festgestellt werden. In dieser Transkriptom-Analyse wurden die S. aureus-Stämme in RPMI- und TSB-Medium in der exponentiellen und stationären Wachstumsphase untersucht. Es konnten insgesamt 416 chromosomale Regionen identifiziert werden, deren Transkriptmenge in einer der vier Bedingungen in der Δrho-Mutante im Vergleich zum Wildtyp wenigstens 4-fach erhöht waren. Von diesen Regionen ließen sich nur 11 % annotierten Genen zuordnen, während eine massive Erhöhung der Menge solcher Transkripte festgestellt wurde, die vom Gegenstrang kodierender Gene stammen.
Ausgehend von diesen Befunden wurde in dieser Studie das zelluläre und extrazelluläre Proteom des S. aureus Wildtyps HG001 und der Δrho-Mutante ST1258 verglichen, um die Auswirkungen der Abwesenheit von Rho auf das Proteom zu untersuchen. Dabei lag die Mehrheit der relativ quantifizierten Proteine in erhöhten Mengen in der Δrho-Mutante im Vergleich zum Wildtyp vor. Viele dieser Proteine konnten dem SaeRS-Zweikomponentensystem von S. aureus zugeordnet werden. In der Proteomanalyse konnten 34 von 39 Proteinen, die durch SaeR reguliert werden, quantifiziert werden. Von diesen wiesen 29 erhöhte Proteinmengen in der Δrho-Mutante auf. Durch das Sae-System werden Gene reguliert, von denen die meisten für Virulenzfaktoren, wie Adhäsine, Toxine und immune evasion-Proteine, kodieren. Die Daten der Proteomanalyse zeigen, dass in S. aureus-Zellen, denen die Aktivität von Rho fehlt, das Sae-System aktiviert wird und dadurch die Induktion des SaeR-Regulons zu beobachten ist.
Die Relevanz dieser Ergebnisse wurde durch ein in vivo-Infektionsexperiment untersucht. In einem Bakteriämie-Modell führte die Inaktivierung von Rho zu einer signifikant erhöhten Virulenz von S. aureus, welche sich in einer signifikant reduzierten Überlebensrate der Mäuse äußerte. Zwischen dem Wildtyp und dem Komplementationsstamm konnte kein signifikanter Unterschied in der Überlebensrate der infizierten Mäuse gezeigt werden.
Es ist bekannt, dass SaeRS-abhängige Virulenzfaktoren auch für die Invasion in Epithel- und Endothelzellen entscheidend sind. Anhand der Zahl der internalisierten S. aureus-Bakterien nach Infektion von humanen Lungenepithelzellen konnten in dieser Arbeit keine Unterschiede zwischen dem Wildtyp HG001 und ∆rho-Mutante ST1258 im zeitlichen Verlauf festgestellt werden. Dabei konnten weder Unterschiede im Überleben in 16HBE14o- Zellen noch in der Internalisierungsrate in A549-Zellen zwischen den beiden Stämmen gezeigt werden.
Das Antibiotikum Bicyclomycin ist ein spezifischer Inhibitor des Transkriptionsterminationsfaktors Rho und wird in Studien zur Rho-abhängigen Transkriptionstermination in Gram-negativen Bakterien eingesetzt, da in diesen Rho ein essentielles Protein ist. In Transkriptom- und Proteomanalysen konnten vergleichbare Effekte durch die Behandlung des Wildtyps mit Bicyclomycin wie in der ∆rho-Mutante hervorgerufen werden. Die Antisense-Transkription und die Expression SaeRS-abhängigen Gene waren im Wildtyp nach Gabe von Bicyclomycin deutlich erhöht. Es konnte gezeigt werden, dass die Aktivierung des Sae-Systems unter Rho-defizienten Bedingungen direkt mit der Transkriptionsterminationsaktivität von Rho verbunden ist und eine neue Verbindung zwischen antibiotischer Wirkung und schädlicher Virulenzgenexpression in S. aureus herstellt werden konnte. In anderen Studien konnten Effekte von Antibiotika auf die Expression von Virulenzfaktoren in S. aureus gezeigt werden, jedoch wurden in diesen Studien die Effekte von Anti-Staphylokokken-Wirkstoffen untersucht. Im Gegensatz dazu ist im Fall von Bicyclomycin ein Antibiotikum verwendet worden, das gegen Gram-negative Bakterien wirksam ist und dennoch die Expression von Virulenzfaktoren in S. aureus beeinflusst. Diese Untersuchungen haben damit auch klinische Relevanz, nicht nur für Patienten, die an gemischten Infektionen mit verschiedenen Bakterienarten leiden, sondern auch für Patienten mit einer Gram-negativen bakteriellen Infektion, die jedoch Träger von S. aureus sind.
The human antibody response to experimental colonization with Staphylococcus aureus NCTC8325-4
(2008)
The four main work packages and their most important results are briefly described as following. 1. Characterization of the extracellular proteome of S. aureus NCTC8325-4 Reference maps of the extracellular proteins of S. aureus NCTC8325-4 were produced at pH ranges 6-11 and 4-7. In total, 119 (pH 6-11) and 177 (pH 4-7) protein spots were identified, corresponding to 48 and 114 proteins, respectively. Among them were many well-known virulence factors such as alpha-hemolysin (Hla), beta-hemolysin Hlb, gamma-hemolysin subunits (HlgA-C), hyaluronate lyase (HysA) and staphylococcal superantigen-like protein 11 (Ssl11). We also detected various extracellular enzymes, which can cause tissue degradation and are involved in nutrient acquisition, for example, autolysin (Atl), glycerol ester hydrolase (Geh), lipase (Lip), thermonuclease (Nuc), several serine proteases SplA-F (SplA-F), V8 protease (SspA), cysteine protease (SspB), staphopain thiol proteinase (88195808, SspP). Many of these proteins probably also contribute to the virulence of S. aureus. 2. Optimization of a 2-D immunoblot (IB) method for the comprehensive investigation of IgG binding to S. aureus extracellular proteins (strain NCTC8325-4) The immune proteome of S. aureus NCTC8325-4 was revealed by probing 2-D blots of S. aureus extracellular proteins at the two pH ranges 6-11 and 4-7 with a pool of sera from 16 volunteers. IgG binding was detected with high sensitivity using a peroxidase-coupled secondary Ab in combination with an ECL-substrate. With application of the software package Delta2D, we could clearly define 66 immune reactive spots on the immunoblots (IBs) of pH range 6-11 and 38 spots on IBs of pH range 4-7. 72 of these 104 immune reactive spots could be identified by matching the IBs with the protein reference maps. These spots represented 36 identified proteins, many of which are known virulence factors, or they are involved in bacterial cell wall biosynthesis and degradation. Generally, the most abundant proteins were also highly immune reactive, but there was no strict correlation between protein abundance and immune reactivity. Some low abundance proteins, especially basic proteins, showed high immune reactivity on 2-D IBs, for example, Atl, 88195808 (SspP) and iron-regulated surface determinant protein A (IsdA). On the other hand, we observed proteins, which were present in large amounts but did not bind IgG such as peptidoglycan hydrolase (LytM) and a hypothetical protein 88193909 (SAOUHSC_00094). 3. Determination of the anti-staphylococcal Ab profiles of S. aureus carriers and noncarriers Comparing the serum IgG binding patterns of sera from the 16 individual volunteers, we observed pronounced heterogeneity in total IgG binding, spot patterns and spot intensities. Five spots were stronger in carriers than in noncarriers (P< 0.05, Mann-Whitney U test). These spots represent IgG binding to SspA, SspB, IsaA, and two hypothetical proteins. A principal component analysis based on differential IgG binding to these spots showed that the carriers were more closely related to each other than the noncarriers, but that they could not be clearly separated from the noncarriers. 4. Does experimental colonization induce changes of the anti-staphylococcal Ab profiles? Finally, we tested whether symptom-free experimental colonization of the 16 volunteers with S. aureus NCTC8325-4 elicited an IgG response. When we compared sera obtained before colonization with those taken 4 weeks after the inoculation with the laboratory S. aureus strain, we did not observe major changes in the Ab patterns. We conclude that short- term colonization with a strain of low virulence does not suffice to induce an Ab production, which is comparable to that present already before the colonization. Thus, either long term high density colonization is required, or as we consider most likely, the adaptive immune response is primarily triggered by (minor) S. aureus infections. Taken together, in this work we have separated the soluble proteins from complex extracellular S. aureus protein extracts with good reproducibility, large coverage (pH 6-11 and 4-7) and high resolution. With application of an ECL substrate, our 2-D immunoblotting procedure resulted in the highly sensitive detection of IgG binding over a wide range of signal intensities. The most important finding with this technique was the pronounced variability of anti-staphylococcal Ab profiles in healthy adults. This could well explain differences in susceptibility to S. aureus infection and its complications. The Ab responses are presumably triggered by long-term colonization or, more likely, by minor infections with S. aureus, since experimental nasal colonization of healthy volunteers with a bacterial strain of low virulence did not induce impressive changes in the Ab profiles.
Our modern understanding of the hygiene hypothesis is that bacteria are not only the cause of disease but also essential for a healthy immune response and regulation. Varied microbial exposure prenatally and in early childhood protects us from pathological immune reactions such as autoimmune diseases and allergies. Against this background, the hypothesis that bacteria can act as allergens appears paradoxical. Nevertheless, there is growing evidence that Staphylococcus aureus (S. aureus) is associated with allergic reactions and serine protease-like proteins (Spls) produced by S. aureus have been identified as pacemakers of allergic reactions. To open prospects for treatment or causal therapy in patients at risk, the underlying mechanism of allergy induction by Spls was studied, focusing on the IL-33 pathway in airway inflammation. In a murine asthma model C57BL/6 J wild-type mice were repeatedly exposed to SplD via intratracheal application. After two weeks a Th2-biased inflammatory response was observed in the airways: IL-33 and eotaxin production, eosinophilia, bronchial hyperreactivity, and goblet cell hyperplasia. Blocking IL-33 activity with its soluble receptor ST2 counteracted these effects: significantly decreased numbers of eosinophils, IL-13+ type 2 ILCs, IL-13+CD4+ T cells as well as reduced IL-5 and IL-13 production by lymph node cells were observed. This study indicates that SplD induces allergic airway inflammation via the IL-33/ST2 axis. IL-33 upregulation was not accompanied by cell death, which indicates that IL-33 may not be passively released by dying cells but actively secreted by the airway epithelium. Future identification of the physiological substrates of the Spls may help to shed light on the source of IL-33 in SplD-induced airway inflammation.
While the causes of allergy induction by S. aureus Spls were addressed by investigating the underlying mechanism, the consequences of this were also of interest: Does the pro-allergenic response to S. aureus affect patients exposed to S. aureus in their airways? Therefore, the humoral and cellular immune response against Spls was studied in cystic fibrosis (CF) patients who are more frequently colonized with S. aureus than the healthy population and suffer from frequent recurrent airway infections. In this patient cohort a Th2 shift of the Spl-specific immune response became evident, including high Spl-specific serum IgE levels, strong induction of Th2 cell differentiation and production of type 2 cytokines following ex vivo stimulation with recombinant Spls. The observed response seems to be specific for Spls rather than being a general feature of S. aureus proteases since other putative allergens of S. aureus (ScpA, SspB) did not show increased IgE binding in CF sera. The Th2-driven immune response might impede antibacterial clearance and worsen the clinical picture. Larger clinical studies are needed to validate this notion by correlating the anti-S. aureus immune response with clinical parameters and testing new therapy options.
These results and findings shed light on a novel, possibly underestimated facet of the immune response against S. aureus and give impetus for further research on bacterial allergens in general, reaching beyond the species S. aureus.
Influenza A Virus (IAV), Staphylococcus aureus (staphylococci), and Streptococcus pneumoniae (pneumococci) are leading viral and bacterial causes of pneumonia. Dendritic cells (DCs) are present in the lower respiratory tract. They are characterized by low expression of co-stimulatory molecules, including CD80 and CD86 and high capacity of antigen uptake. Subsequently, DCs upregulate co-stimulatory signals and cytokine secretion to effectively induce T-cell priming. Here, we investigated these processes in response to bacterial and viral single as well as coinfections using human monocyte-derived (mo)DCs. Irrespective of single or coinfections, moDCs matured in response to IAV and/or staphylococcal infections, secreted a wide range of cytokines, and activated CD4+, CD8+ as well as double-negative T cells. In contrast, pneumococcal single and coinfections impaired moDC maturation, which was characterized by low expression of CD80 and CD86, downregulated expression of CD40, and a mild cytokine release resulting in abrogated CD4+ T-cell activation. These actions were attributed to the cholesterol-dependent cytotoxin pneumolysin (Ply). Infections with a ply-deficient mutant resulted in restored moDC maturation and exclusive CD4+ T-cell activation. These findings show that Ply has important immunomodulatory functions, supporting further investigations in specific modalities of Ply-DC interplay.
Staphylococcus aureus can be a harmless colonizer of the human body, which colonizes about 20-30% of the population. If S. aureus overcomes the outer physical barrier of the body, comprised of the skin and mucous surfaces, it can also cause severe diseases such as endocarditis, pneumonia, or sepsis. S. aureus possesses a variety of secreted and surface bound virulence factors to mediate attachment and invasion into the host, to disseminate an infection and to modulate and evade the immune system. But not only the huge amount of virulence factors turn S. aureus into a dangerous human pathogen, also its resistances to a broad spectrum of commonly used antibiotics make infections hard to treat. During the last years it became apparent that S. aureus can be internalized by as well as replicate and persist in professional and non-professional phagocytic cells. It is suggested that the intracellular compartment protects S. aureus from antibiotic treatment and the immune system. To accomplish the adaptation to the intracellular compartment, S. aureus needs to regulate its gene expression by regulatory systems. One of these regulators is the alternative sigma factor SigB, which directly and indirectly regulates the expression of about 200 genes in vitro. However, the stimuli leading to the activation of SigB in S. aureus are barely known and also its role during an infection varies, depending on the S. aureus strain and infection model used. Therefore, the importance of SigB during the early adaption of S. aureus to the intracellular environment should be elucidated using a cell culture infection model. First, the existing cell culture infection workflow had to be modified to improve the data analysis and to increase the yield of identified proteins to comparatively monitor the adaption reaction of S. aureus HG001 and its isogenic ΔsigB mutant to the intracellular milieu of S9 human bronchial epithelial cells. The proteome analysis in conjunction with RT-qPCR analysis of the wild type and the ΔsigB mutant revealed a fast and transient activation of SigB directly after internalization. Quantitative analysis of the intracellular bacterial titer demonstrated a requirement of SigB for intracellular replication. Differences in the proteome composition of the ΔsigB mutant in comparison to the wild type after internalization reflected the different growth rates, resistance to antibiotics and toxic compounds, adaptation to oxidative stress, and protein quality control mechanisms. The accessory gene regulator (Agr) is like SigB also a global regulator of gene expression in S. aureus. To elucidate possible benefits in the intracellular survival of the co-occurrence of S. aureus wild type and Δagr mutant cells, like it can be found in sites of an infection, a co-infection assay was established. With the co-infection assay the simultaneous and competitive intracellular survival in comparison to the individual intracellular survival was followed for three days post-infection (p.i.). The single and the co-infection revealed that the wild type was able to replicate more efficiently during the first hours p.i. than the Δagr mutant, but the mutant was able to survive more efficiently. The extracellular proteome of S. aureus represents the key compartment for virulence factors. Virulence factors are secreted or bound to the surface of the S. aureus cell. With the infection workflow applied in this study, secreted proteins are lost during the enrichment of the intracellular bacteria for proteome analysis. Therefore, no information about the levels or the regulation of virulence factor expression can be acquired in the cell culture infection model using cell sorting approaches. Hence, the extracellular proteome of S. aureus was analyzed in vitro from shake flask experiments. To get a comprehensive overview of the regulatory impact of different global regulators onto the secretome, S. aureus LS1 mutants lacking the global regulators Agr, SarA and SigB were compared to the respective wild type. Additionally the protein level of the secretome of the well characterized and frequently used S. aureus strains 6850, CowanI, HG001, LS1, SH1000, and USA300 was comparatively analyzed. This project was performed in collaboration with the group of Prof. Löffler from the Institute of Medical Microbiology in Jena. The data of the extracellular proteome generated in this thesis were combined with phenotypic and toxicity data to explain strain differences in invasiveness, cytotoxicity, phagosomal escape, and intracellular persistence in infection experiments.
Thiol or sulfhydryl groups are highly reactive functional groups in cellular systems. Molecules carrying thiol groups are mostly derivatives of the amino acid cysteine and are grouped as low molecular weight (LMW)-thiols: coenzyme A (CoA), glutathione (GSH) or bacillithiol (BSH). LMW-thiols can help in the maintenance of the reduced cellular environment as so called redox-buffers. Additionally, they act as co-factors in enzyme reactions or help in the detoxification of reactive oxygen or nitrogen species, electrophilic compounds or thiophilic metalloids (arsenite, tellurite). In proteins from different organisms cysteine is underrepresented compared to other amino acids, but still overtakes diverse roles. It is an important determinant in the tertiary and quaternary structure of proteins. The nucleophilic character of the thiol or thiolate group, respectively, makes cysteine the catalytically active amino acids of different enzymes. As a precursor cysteine participates in the formation of Fe-S clusters and coordinates different co-factors like heme, iron or zinc. The main goal of this study was the investigation of the different cellular thiol pools, now defined as the thiolome. The thiolome is the entity of the cellular thiol pools, i.e. LMW-thiols and protein thiols, and the dynamics between these pools. In Bacillus subtilis and Staphylococcus aureus mixed disulfides between protein thiols and free LMW-thiols, so called S-thiolations, were identified in different proteins in response to the thiol specific reagent diamide. Some of these S-thiolations were located at catalytically active cysteine residues. Subsequent analysis of metabolites supports this: the S-thiolation of the cobalamine-independent methionine-synthase MetE led to a decrease of the cellular methionine content. Additionally, the conversion of threonine to different branched-chain amino acids (BCAAs) was disrupted by the S-thiolation of the branched-chain amino acid aminotransferase YwaA, thereby probably inducing the synthesis of ppGpp, the alarmon of the stringent response. In addition to the identification of S-thiolations a technique was established which allowed the discrimination between intra- and intermolecular disulfides. The non-reducing/ reducing diagonal gel electrophoresis was applied to B. subtilis and S. aureus and confirmed known existing disulfide bonds, e.g. in alkyl hydroperoxide reductase AhpC or the thiol peroxidase Tpx. In response to diamide an increase of specific disulfide bonds in different proteins was observed. The analysis of the LMW-thiol content by an HPLC-approach allowed the observation of the dynamics of the thiolome. In response to diamide the reduced LMW-thiol content decreased by 75%, reduced protein thiols by 60%. Collaborations with other working groups allowed the identification of BSH in this approach. Additionally, an unknown thiol was found that is likely a derivative of BSH. Screening of the LMW-thiol content of different S. aureus-strains under various growth conditions revealed that strains 8325-4 and SH1000 lack BSH. The lack of BSH was attributed to an 8 bp-duplication in the bshC-gene that encodes the last enzyme of the BSH-synthesis. BSH-production was restored by transducing plasmid-borne functional BshC from strain Newman into strains 8325-4 and SH1000. The reconstitution of the BSH-synthesis aided in the resistance to the antibiotic fosfomycin but did not increase the resistance to different oxidants (diamide, sodium hypochlorite, hydrogen peroxide). The production of BSH had also positive effects on the survival of S. aureus inside human bronchial epithelial cells and murine macrophages in phagocytosis assays. Additionally, a GSH-uptake was observed into S. aureus which has before been known as a GSH-free bacterium. Taken together, this thesis provides the first insights into both, the LMW-thiol- and protein thiol pool of low GC, Gram-positive bacteria under different conditions. A plethora of different methodologies was used to describe the thiolome. The bacterial thiolome is a sophisticated system which is tightly regulated, but also flexible enough to not rely on determined molecules like BSH. The influences of the thiolome are not restricted to its own system and regulation, but also affect different branches of cellular physiology like the metabolism of BCAAs.
Bacterial infections represent an increasing threat in human health and hospital- acquired infections meanwhile account for 99,000 deaths every year in the United States (Ventola, 2015). Live-threating bacterial infections will certainly emerge to an even more serious concern in future, essentially by accelerated development of antibiotic resistance. Only recently, the discovery of plasmid-encoded mcr-1, that confers resistance against colistin, marks the point where this highly transmissible resistance mechanism is now reported for every so far developed antibiotic (Liu et al., 2016). Staphylococcus aureus is a Gram-positive bacterium and well-known for its ability to quickly acquire resistance toward antibiotics either by chromosomal mutations and/or horizontal gene transfer (Pantosti et al., 2007). Although approximately 30% of the population is colonized with S. aureus (Kluytmans et al., 1997), it can transform to an invasive pathogen that causes a wide range of severe infections including pneumonia. The success of S. aureus as opportunistic pathogen can be attributed to combinations of several beneficial properties and capabilities including the expression of an arsenal of virulence factors (Archer, 1998), intracellular persistence (Garzoni & Kelley, 2009) and subversion of host cell defense mechanisms (Schnaith et al., 2007). The airway epithelium is the first line of defense against bacterial pathogens by forming a relative impermeable physical barrier composed of epithelial cells that are linked by tight junctions, desmosomes and adherence junctions (Davies & Garrod, 1997). Additionally, the airway epithelium mediates the detection of bacterial pathogens via toll-like receptors (TLRs) that recognize a variety of bacterial molecular patterns such as lipopolysaccharide (LPS), peptidoglycan and flaggelin (Sha et al., 2012). This interaction is transduced via protein phosphorylations into the cell in order to promote adaptation to the infection by initiation of the adaptive and innate immune defense. Although few insights where obtained of the signaling host responses towards staphylococcal infections (Agerer et al., 2003; 2005; Ellington et al., 2001), a comprehensive description of the host signaling network is largely missing. Thus, this dissertation thesis focuses on the decipherment of phosphorylation-mediated signaling responses towards S. aureus infections in non- professional and professional phagocytes by mass spectrometry-based phosphoproteomic techniques. The results of this thesis are summarized in the four chapters. Chapter I introduces to recent advances in the development of methodologies applied in the field of phosphoproteomics, including quantification strategies, peptide fractionation techniques and phosphopeptide enrichment methods applied for the system-wide characterization of protein phosphorylations by mass spectrometry. Additionally, publications reporting phosphorylation-based host signaling responses towards bacterial pathogens or their molecular patterns that applied mass spectrometry-based phosphoproteomics are discussed. In chapter II, the responses of the human bronchial epithelial cell lines 16HBE14o- and S9 following challenge with staphylococcal alpha- toxin at the level of proteome and phosphoproteome are summarized. General and cell type-specific signaling events are highlighted and evidences linking the activity of the epidermal growth factor receptor (EGFR) with differences in tolerance toward alpha-toxin are provided. Chapter III describes the modulation of the host signaling network of 16HBE14o- airway epithelial cells triggered by infection with S. aureus including temporal dissection of signaling events. Several protein kinases were identified as important signaling hubs mediating the host response. Targeted pharmaceutical inhibition of these kinases was probed and resulted in reduction of intracellular bacterial load. Chapter IV describes the rearrangement of the kinome by the differentiation of THP-1 monocytes to macrophage-like cells by application of quantitative kinomics. This approach identified the kinase MAP3K7 (TAK1) as key mediator of bacterial clearance, chemokine secretion and the differentiation process itself.
Die Atemwege sind mögliche Eintrittspforten für Staphylococcus aureus in den menschlichen Organismus. Inhalierte Bakterien oder Bakteriencluster kommen initial vermutlich nicht direkt mit den Epithelzellen der Atemwege in Kontakt, sondern nur mit der aufgelagerten Mukusschicht. Die Mikroorganismen nehmen in dieser Situation möglicherweise über sekretorische lösliche Virulenzfaktoren auf die Funktion der Epithelzellen Einfluss und können dadurch das Infektionsgeschehen für sich günstig beeinflussen. Die Behandlung einer Infektion ist oft schwierig, da viele S. aureus-Stämme resistent gegenüber Antibiotika sind. Es ist daher von großem Interesse, mehr über die vielfältigen Interaktionen dieser Bakterien mit ihren eukaryotischen Wirtszellen in Erfahrung zu bringen. Bisher ist nur wenig über die Reaktionen humaner Atemwegsepithelzellen auf Kontakt mit S. aureus-Sekretionsprodukten bekannt, deswegen wurden in dieser Arbeit die Effekte der löslichen Virulenzfaktoren, Hämolysin A und B, auf die Zellmorphologie, Zytokinsezernierung und Ca2+-Signaltransduktion in verschiedenen humanen Atemwegsepithelzellen (16HBE14o-, S9, A549) genauer charakterisiert. Unter rHla-Einwirkung konnte in konfluenten Zellrasen die Bildung parazellulärer Lücken beobachtet werden, wobei die Stärke der Reaktion zelltypspezifisch war. Für die in vivo-Situation könnte der Verlust des stabilen Zellverbands bedeuten, dass das Bakterium dadurch die Möglichkeit erhielte, in den Wirtsorganismus einzudringen. Die Untersuchungen an primären Nasenepithelzellen unterstützen diese Schlussfolgerung. Hingegen zeigten Hämolysin B und die bakteriellen Zellwandbestandteile Lipoteichonsäure und Peptidoglykan kaum Effekte auf die Morphologie der Zellen. Durch fluorometrische Messung mit Indo1-beladenen Zellen wurde deutlich, dass die rHla-Behandlung und der daraus resultierende Einbau von Hla-Poren in die Membran der Atemwegsepithelzellen zu einem Ca2+-Einstrom in die Zellen führen. Wurden die A549-Zellen mit höheren Hla-Konzentrationen behandelt, war der Ca2+-Einstrom sehr stark und konnte nicht durch den zelleigenen Ca2+-Auswärtstransport kompensiert werden, so dass die intrazelluläre Ca2+-Konzentration [Ca2+]i stetig anstieg. Diese Ca2+-Überladung könnte zur Schädigung der Zellen oder gar zum Absterben einiger Zellen beigetragen haben, was in den Experimenten mit dem Time lapse-Mikroskop beobachtet wurde. Auch die Behandlung der A549-Zellen mit rHlb, durch dessen Sphingomyelinase-Aktivität Spaltprodukte entstehen können, die selbst als Signalmoleküle fungieren, führte zu einer leicht veränderten [Ca2+]i in den A549-Zellen. Ob dieses durch Sphingosin-1-Phosphat erfolgt, das in A549-Zellen tatsächlich ein deutliches Ca2+-Signal erzeugt, oder durch andere Hlb-bedingte Effekte auf die Zellen, wurde nicht abschließend geklärt. Auch der direkte Einfluss der beiden Hämolysine auf die Freisetzung von pro-inflammatorischen Zyto- und Chemokinen aus den Atemwegsepithelzellen unter rHla und rHlb wurde quantitativ bestimmt. Mit Hilfe von FlowCytomix-Kits konnte ebenfalls gezeigt werden, dass beide Hämolysine die Sekretion von IL-6 und IL-8 aus den Zellen bewirken. Um die physiologischen Vorgänge im respiratorischen Gewebe nach Kontakt mit S. aureus bzw. dessen Virulenzfaktoren zu ergründen, wurden in dieser Arbeit verschiedene endogene Proteinkinasen und Signalmoleküle der Atemwegsepithelzellen pharmakologisch inhibiert und untersucht, wie sich die selektive Hemmung der Signaltransduktion auf die Lückenbildung im Zellrasen unter der Stimulation mit rHla auswirkt. Da die intrazelluläre Konzentration von Ca2+-Ionen für die Steuerung der Salz- und Wassersekretion im respiratorischen Gewebe und somit für die Abwehr potentieller Pathogene wichtig ist, wurden für diese Arbeit einige Schlüsselelemente dieses Systems analysiert. Die Resultate weisen auf eine komplexe Verbindung der Signalwege hin, wobei die Zellantworten häufig Zelltyp-spezifisch waren. Es konnte durch Time lapse-Beobachtungen gezeigt werden, dass Calmodulin, c-Src, Calpaine, die Proteinkinasen A, G, B und C sowie NF-κB den Zellen tendenziell helfen, ihre Zellform unter rHla-Einwirkung zu bewahren. Für Calmodulin, die Ca2+/CaM abhängige Kinase II, ERK1/2, p38 und NF-κB wurde eine Beteiligung an der Erhöhung der Sekretionsraten von IL-8 und IL-6 durch rHla sowie rHlb festgestellt. Die Ergebnisse deuten darauf hin, dass die untersuchten Signalwege, je nach Intensität der Einwirkung der bakteriellen Faktoren auf die Atemwegsepithelzellen, sowohl zellprotektive als auch Epithel-beeinträchtigende Prozesse beeinflussen, jedenfalls aber in die Produktion von Signalen (Freisetzung von Zyto- und Chemokinen) eingebunden sind, die solcherart Epithelzellen in vivo an das Immunsystem eines Wirts senden.
Staphylococcus aureus is a commensal colonizing 20-30% of the population as well as a pathogen causing diverse diseases ranging from skin infections via toxin mediated diseases to life threatening conditions. In its interplay with the human host, this microorganism resorts to an extensive repertoire of both membrane-bound and secreted virulence factors facilitating adhesion to, invasion of, and spreading into various host tissues. Among the numerous virulence factors produced by S. aureus are the staphylococcal superantigens (SAgs). They directly cross-link conserved regions of the T cell-receptor with MHC class II molecules (outside the peptide-binding cleft) on antigen presenting cells. This results in a strong stimulation of up to 20% of all T cells which respond with proliferation and massive cytokine release. Recently, the enterotoxin gene cluster (egc) located on a pathogenicity island was described. The egc-genes are the most prevalent SAg genes in commensal and invasive S. aureus isolates. However, they appear to cause toxic shock only very rarely and their presence is negatively correlated with severity of S. aureus sepsis. Therefore it was suggested that SAgs might differ in their pro-inflammatory potential. In addition to their superantigenicity, SAgs also act as conventional antigens and induce a specific antibody response. In contrast to non-egc SAgs, despite the high prevalence of egc SAgs, neutralizing antibodies against egc SAgs are very rare, even among carriers of egc-positive S. aureus strains. In order to find an explanation for this “egc-gap”, we have tested two non-exclusive hypotheses: (i) egc and non-egc SAgs have unique intrinsic properties and drive the immune response into different directions and (ii) egc and non-egc SAgs are released by S. aureus under different conditions, which shape the immune response to them. To test these hypotheses, we compared the effects of egc and non-egc SAgs on human blood cells. Their T cell-mitogenic potencies, the elicited cytokine profiles as well as their impact on gene expression were highly similar. Both egc and non-egc SAgs induced a very strong pro-inflammatory response. In contrast, the regulation of SAg release by S. aureus differed markedly between egc and non-egc SAgs. Egc-encoded proteins were secreted by S. aureus during exponential growth, while non-egc SAgs were released in the stationary phase. We conclude that the distinct biological behavior of egc and non-egc SAgs is not due to their intrinsic properties, which are very similar, but is caused by their differential release by S. aureus. Traditionally, S. aureus has not been considered as an intracellular pathogen but strong evidence emerged indicating that staphylococci can invade and persist in various cell types. Internalization might constitute a bacterial strategy to evade the host’s defense reactions and the action of antibiotics. The intracellular niche might thus constitute a reservoir for chronic or relapsing infections. Contrary to their potential importance, genome-wide functional genomics analyses of the adaptation reactions of S. aureus to the host cell environment are rare and so far confined to gene expression profiling. Investigations addressing the proteome of internalized S. aureus are still lacking due to the challenge of obtaining a sufficient number of infecting bacteria. The proteome of other pathogens such as Francisella tularensis has been characterized by classical 2-DE approaches. However, the number of bacteria required for such a 2-DE based approach is often exceeding the numbers available from in vivo infection models. Furthermore, this approach does not allow monitoring of time-dependent quantitative changes in protein levels. Here, a workflow allowing time-resolved analysis of internalized S. aureus by combining pulse-chase stable isotope labeling by amino acids in cell culture with high capacity cell sorting, on-membrane digestion, and high-sensitivity mass spectrometry is presented. This workflow permits detection and quantitative monitoring of several hundred staphylococcal proteins from as little as a few million internalized S. aureus cells. This approach has been used to reveal time-resolved changes in levels of proteins in S. aureus RN1HG upon internalization by human bronchial epithelial cells. Proteins involved in stress adaptation as well as protein folding and some components of the phosphotransferase system were upregulated in internalized staphylococci, whereas proteins of the purine biosynthesis pathway and tRNA aminoacylation were downregulated. Furthermore, regulatory adaptive responses of internalized S. aureus to the intracellular milieu were shown as global regulators displayed increased protein abundance levels compared to non-internalized bacteria. Taken together, we observed changes in levels of proteins with functions in protection against oxidative damage and adaptation of cell wall synthesis in internalized S. aureus.
Im Rahmen dieser Dissertation wurden die antimikrobiellen Effekte der Phytopharmaka
BNO 101 und Myrtol stand. auf Staphylococcus aureus direkt miteinander verglichen. Für
BNO 101 umfassten die Untersuchungen Wachstumsexperimente mit Messungen der
Optischen Dichte und Experimente zur CFU-Bestimmung. In keinem dieser Experimente
konnten antimikrobielle Effekte auf S. aureus unter Behandlung gezeigt werden. Für Myrtol
stand. wurden Wachstumsexperimente analog durchgeführt. Hierbei konnte ein deutlicher
bakteriostatischer Effekt auf S. aureus und verglichen mit BNO 101 eine höhere Wirksamkeit
nachgewiesen werden.
Unter der Gesamtkonzentration von 0,25% Myrtol stand. liegen die Überlebensraten der
Bakterien 4 h bis 24 h nach Behandlung bei unter 40% im Vergleich zu der Kontrolle. Um
Ursachen für die antibakteriellen Effekte zu finden, wurden die Zellen mittels
Rasterelektronenmikroskopie morphologisch zu verschiedenen Zeitpunkten nach Behandlung
untersucht und eine Myrtol stand.-spezifische Volumenzunahme von bis zu 69% ermittelt.
Zusätzlich wurden Proteinproben der Zellen mittels 2D-DIGE aufgetrennt. Hierbei wurden
separat intrazellulär 1223 sowie extrazellulär 610 Proteinspots detektiert und miteinander
verglichen. Durch Behandlung mit 0,25% Myrtol stand. wurde das S. aureus Proteom über den
gesamten Messzeitraum von 24 h nach Behandlung massiv verändert. Mittels
anschließendem tryptischen Verdau und Massenspektrometrie (LC-MS) signifikant
veränderter Spots, konnte eine Vielzahl von Proteinen identifiziert und davon 54 verschiedene
Proteine einzelnen Stoffwechselwegen durch Datenbankabgleich und Literaturrecherche
zugeordnet werden. Bemerkenswert ist die deutliche Reduktion der Virulenzfaktoren des
Bakteriums durch Myrtol stand. Behandlung. Unter anderem konnten für Superantigen Enterotoxine, Leukotoxine, Hämolysine und Serine-Proteasen und den Genregulator Agr
deutlich verminderte Proteinmengen nach Behandlung gemessen werden. Die veränderten
Proteinmengen sind hierbei sowohl auf eine Umverteilung der Proteine zwischen den
Zellkompartimenten, als auch auf deutliche Regulation in der Proteinbiosynthese
zurückzuführen. Neben den Virulenzfaktoren ließen sich bspw. auch zahlreiche Enzyme der
Zellwand- und Zellmembransynthese sowie des Energiemetabolismus mit deutlich
veränderten Proteinmengen nachweisen, die für das Überleben der Bakterienzellen kritisch
sind. Mittels Direktverdau und nachfolgender LC-MS der Proteinproben wurden die
Ergebnisse bestätigt und weitere regulierte Proteine identifiziert.
Im Rahmen dieser Dissertation konnten antimikrobielle Effekte von Myrtol stand. auf
Staphylococcus aureus nachgewiesen und deren Ursachen aufgezeigt werden. Die
ausführlichen Proteinanalysen nach Behandlung mit Myrtol stand. lassen auf eine starke
verminderte Virulenz des Bakteriums schließen. Angesichts des Bedarfs an zielgerichteten
Therapieverfahren entsprechend der Phänotypen von CRS und ABRS, bietet die systemische
Gabe von Myrtol stand. hier eine kausale Therapieoption. Die zusätzliche Möglichkeit einer
topischen Anwendungsform kann angesichts der hier gezeigten Wirkungen eine
vielversprechende Behandlungsmaßnahme sein und sollte Ziel klinischer Untersuchungen
werden
Das Auftreten einer postoperativen Wundinfektion bedeutet für den Patienten die Verwirklichung eines gefürchteten persönlichen Risikos, stellt den behandelnden Ärzten oft vor schwer zu lösende Aufgaben und belastet die Solidargemeinschaft durch einen erheblichen Kostenanstieg. Obwohl Staphylococcus aureus weltweit als der häufigste und gefährlichste Erreger von SSI gilt, muss jede Klinik die lokalen Gegebenheiten (Erreger-Prävalenz, Resistenzlage etc.) kennen und sich ihnen stellen.
Ziel der vorliegenden Arbeit war es, die Bedeutung von Staphyloccocus aureus für die Klinik und Poliklinik für Unfall-, Wiederherstellungschirurgie und Rehabilitative Medizin der Universitätsmedizin Greifswald zu untersuchen. Dazu wurden drei klinische Studien durchgeführt: zur Erfassung der Prävalenz von MRSA und MSSA, zur Untersuchung der Effektivität präoperativer Hautantiseptik bei unfallchirurgischen Patienten sowie zur Frage, ob Staphylococcus aureus als verursachendes Pathogen einer Implantat-assoziierten Infektion einen Risikofaktor für ein Wiederauftreten der Infektion nach erfolgter Therapie darstellt.
Es konnte gezeigt werden, dass etwa ein Fünftel der Patienten der Unfallchirurgie Greifswald bereits bei Ankunft im Krankenhaus Träger von MRSA oder MSSA war. Während operativer Eingriffe gelang trotz einer leitliniengerecht durchgeführten Hautantisepsis nur bei 65% der Patienten eine vollständige Keimreduktion. In einem Fall konnte die Verschleppung eines MSSA-Klons von der präantiseptischen Hautflora in die postantiseptische Wundflora bewiesen werden. Nicht zuletzt hatten Patienten mit durch MSSA infiziertem Osteosynthesematerial ein deutlich erhöhtes Risiko einer Re-Infektion nach zunächst erfolgreicher Beruhigung der Infektion.
Die Ergebnisse der drei durchgeführten Studien zeigen, dass Staphylococcus aureus auch in Greifswald bei der Behandlung unfallchirurgischer Patienten die antizipierte, bestimmende Rolle spielt. Prävalenz des Pathogen, Persistenz trotz etabliertem perioperativen Hygieneregime und Auswirkung einer tatsächlich eingetretenen Infektion auf die Heilungschancen wurden dargelegt.
Den Fokus perioperativer Hygiene-Maßnahmen zur Vermeidung von SSI weiterhin auf Gram-positive Erreger, namentlich Staphylokokken, zu richten, ist aktuell in der Klinik für Unfallchirurgie in Greifswald gerechtfertigt.