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Die vorliegende Arbeit adressiert die Nutzbarkeit des humanen Speichelproteoms als diagnostisches Instrument im Kontext einer oralen Mukositis bei Kopf- und Halskarzinoms. Als häufigste Nebenwirkung einer Radio(chemo)therapie kann die Mukositis therapielimitierend sein und hat für betroffene Patienten meist eine Einschränkung ihrer Lebensqualität zur Folge. Trotz der guten Verfügbarkeit von Speichel existieren wenige Studien, welche zeigen, dass das Speichelproteom für die Diagnostik einer Krankheit oder zur Therapieentscheidung nutzbar ist. Das hat unter anderem seinen Grund in der Komplexität der massenspektrometrischen Methode. Die erste Veröffentlichung (Golatowski et al. 2013) erarbeitete deshalb einen Standard in der Probengewinnung von Speichel. Als Ergebnis steht die Empfehlung zur Nutzung eines Paraffin-Kaugummis, aufgrund des hohen Speichelvolumens und der guten Vergleichbarkeit mit der nichtstimulierten Salivation beim identifizierten Proteom. In einer zweiten Veröffentlichung (Jehmlich & Golatowski et al. 2014) wurden C18 Mikrosäulen verschiedener Hersteller bezüglich ihres Einflusses auf die Proteinidentifizierung verglichen. Die Säulen sind notwendig für die Entsalzung und Aufreinigung eines Peptidgemisches. Mit allen verwendeten Säulen konnten ähnliche Ergebnisse erzielt werden, wobei die ZipTip® µC18 sowie C18 Systeme der OASIS® HLB μElution 96er Well Platte und TopTip® C18 Pipettenspitzen leicht überlegen sind. In der letzten Arbeit (Jehmlich et al. 2015) wurden die gewonnenen Erkenntnisse genutzt, um die Speichelproben von Patienten mit Kopf- und Halskarzinom zu untersuchen. Insgesamt zeigten wir die Möglichkeit, alterierte Proteine zwischen zwei Patientengruppen massenspektrometrisch zu detektieren. Mit den gefundenen Daten konnte demonstrieren werden, dass massenspektrometrische Techniken geeignet sind, um schon vor Behandlungsbeginn Patienten zu identifizieren, die für die Entwicklung einer oralen Mukositis prädisponiert sind. Es ist hierbei die Proteinklasse der Metalloproteinasen hervorzuheben, da diese für einen therapeutischen Ansatz gegen Mukositis interessant sind. In Zukunft werden jedoch größere und voraussichtlich multizentrische Studien erforderlich sein, um ausreichend große Patientenkohorten zusammenzustellen und die Klassifikation speziell für Patienten ohne Mukositisrisiko sensitiver zu gestalten.
Humanity is plagued by many diseases. Beside environmental influences, many --- if not all --- diseases are also subject to genetic predisposition and then display molecular alterations such as proteomic or metabolic aberrations. The elucidation of the molecular principles underlying human diseases is one of the prime goals of biomedical research. To this end, there has been an advent of large-scale omics profiling studies. While the field of molecular biology has experienced tremendous development, data analysis remains a bottleneck. In the context of this thesis, we developed a number of analysis strategies for different types of omics data resulting from different experimental settings. These include approaches for associations studies for plasma miRNAs and time-resolved plasma omics data. Furthermore, we devised analyses of different RNA-Seq transcriptome profiling studies coping with problems such as lack of replicates or multifactorial experimental design. We also designed machine learning frameworks for the identification of discriminatory biomolecular signatures analysing case-control or time-to-event data. All of the strategies mentioned above were developed and applied in the contexts of multi-disciplinary endeavours. They aided in the identification of plasma miRNAs associated with age, sex, and BMI as well as plasma miRNAs bearing potential as diagnostic biomarkers for non-alcoholic fatty liver disease (NAFLD). This thesis significantly contributed to a study demonstrating the utility of plasma miRNAs as prognostic biomarkers for major cardiovascular events such as ST-elevation myocardial infarction. Our approaches for analysing RNA-Seq data aided in the characterisation of murine models for Alzheimers disease and the transcriptional response of human gingiva fibroblasts to ionizing radiation exposure. Furthermore, the developed approaches were applied for studying a human model for thyrotoxicosis and for the successful identification of a multi-omics plasma biomarker signature of thyroid status. We are only beginning to understand the molecular principles underlying human diseases. The approaches and results presented in this thesis will contribute to improved understanding of biomolecular processes involved in common diseases such as Alzheimers disease, NAFLD, and cardiovascular diseases.
Thrombozytenkonzentrate (TKs) sind wichtige Blutprodukte für die Therapie von Blutungen unter Thrombozytopenie oder bei Thrombozytenfunktionsstörungen. Trotz moderner Sicherheitsmaßnahmen können Infektionsübertragungen und immunologische Nebenwirkungen durch die Transfusion von Thrombozyten nicht gänzlich ausgeschlossen werden. Pathogeninaktivierungsverfahren (PIV) wurden entwickelt, um Bakterien und Viren in TKs zu inaktivieren und die Sicherheit von TKs weiter zu erhöhen. Zu diesen Verfahren zählen u.a. das Intercept-Verfahren (Amotosalen und UVA-Bestrahlung) und das Theraflex-Verfahren (ausschließlich UVC-Bestrahlung). In dieser Arbeit wurde der Einfluss der PIV durch Amotosalen/UVA und durch UVC auf das Thrombozytenproteom untersucht, welches mit Massenspektrometrie (LC-ESI MS/MS) untersucht wurde.
Hintergrund: Die Phototherapie hat sich bereits in den Leitlinien zur Therapie entzündlicher und immunvermittelter dermatologischer Erkrankungen wie Psoriasis oder dem atopischen Ekzem etabliert. Eine neuere Anwendung ist die intranasale Phototherapie mit mUV/VIS (70 % sichtbares Licht, 25 % UVA, 5 % UVB) zur Behandlung der allergischen Rhinitis. Verschiedene Arbeiten zeigen eine Reduktion der Symptome der allergischen Rhinitis durch mUV/VIS. In der vorliegenden Arbeit wurden die zugrundeliegenden molekularen Mechanismen und Veränderungen auf Proteomebene in humanen respiratorische S9-Epithelzellen untersucht. Methoden: Respiratorische S9-Epithelzellen wurden mit mUV/VIS für 4 min bestrahlt und nach 0, 30 und 60 min (Kurzzeitbereich) sowie nach 24, 48 und 72 h (Langzeitbereich) geerntet. Zum Vergleich unterschiedlicher Dosen wurden zusätzlich Zellen für 2 und 6 min bestrahlt und nach 24, 48 und 72 h geerntet. Die Proteine der Proben wurden extrahiert und mittels 2D-DIGE aufgetrennt. Die resultierenden Gel-Bilder wurden mittels Delta2D-Software analysiert, die detektierten Spots ausgestanzt und mit Trypsin proteolytisch verdaut. Anschließend konnten sie mittels Massenspektrometrie (MALDI-TOF-MS) und dem Datenbankvergleich mit virtuell verdauten Proteinen identifiziert werden. Ergebnisse: Von 1665 detektierten Spots wurden 897 identifiziert und weiter statistisch analysiert. Für die weiteren Analysen wurden nur die im Vergleich zur Kontrolle signifikant veränderten Proteine berücksichtigt (p ≤ 0,05 und Fold Change ≥ 1,5). Die Ergebnisse zeigen eine deutliche Induktion von oxidativem Stress nach mUV/VIS. Dies konnte dosisabhängig mit der Induktion des Nrf2-Pathways, der Hitzeschockproteine und der Induktion der Thioredoxinreduktase 1 nachgewiesen werden. Proteinschäden und Proteinreparatur konnten anhand der Induktion von Hitzeschockproteinen und der Induktion von Proteinen, die mit der Ubiquitin-vermittelten proteasomalen Degradation fehlgefalteter Proteine assoziiert sind, gezeigt werden. Dosisabhängig werden direkt und indirekt durch oxidativen Stress DNA-Schäden induziert. Dies bestätigte sich anhand der dosisabhängigen Induktion von DNA-Reparaturmechanismen (NER). Die Induktion der Apoptose bei massiven Schäden wurde mittels Ingenuity Pathway Analyse (IPA) nachgewiesen. Die Induktion der Tumorgenese ist anhand der dosisabhängig induzierten Anzahl der Tumor-assoziierten Proteine und der induzierten Protoonkogene wie CRK oder des Tumorantigens p53 nachweisbar. In IPA zeigt sich eine dosisabhängige Beeinflussung immunologischer/inflammatorischer Prozesse wie der Psoriasis oder des atopischen Ekzems. Im Zeitverlauf kommt es zum Anstieg der Proteine, die mit solchen Erkrankungen assoziiert sind. Es zeigte sich auch eine dosisabhängige Induktion von Proteinen, die mit Mechanismen der Virusfreisetzung aus der Wirtszelle assoziiert sind. Dies könnte einige klinische Berichte über eine Herpes simplex Virusreaktivierung nach einer mUV/VIS-Bestrahlung erklären. Fazit: Eine Beeinflussung immunologisch/inflammatorischer Prozesse konnte bestätigt werden. Somit ist mUV/VIS zur Therapie der allergischen Rhinitis einsetzbar. Nach aktueller Literatur scheint die Rhinophototherapie nicht für die Karzinogenese zu prädisponieren. Aber es fehlen bisher Langzeit-Studien, die dies bestätigen. Aufgrund der genannten Veränderungen sollte eine mUV/VIS-Behandlung nur nach sorgfältiger Nutzen- und Risikoanalyse erfolgen.
Microbial infections can be either caused by a single species or complex multi-species consortia. One of the most prominent opportunistic human pathogens leading to mono- or mixed-species infections is the Gram-negative bacterium Pseudomonas aeruginosa. Understanding the molecular basis of its adaptation to infection-related stresses is an essential prerequisite for the prevention and treatment of P. aeruginosa infections. We therefore employed state-of-the-art proteomics approaches to elucidate the molecular adaptation mechanisms of P. aeruginosa to infection-related conditions. Moreover, structure, function and interaction of complex microbial consortia containing P. aeruginosa and causing catheter-associated urinary tract infections were investigated by metaproteomics analyses. Our investigations revealed that the adaptation of P. aeruginosa during infection is either based on gene expression changes caused by environmental signal integration or by gene mutations leading to a selective advantage in a particular host environment. In study I, investigating the proteome response of P. aeruginosa biofilms to the clinical relevant antibiotic ciprofloxacin, global changes in the protein profile were observed. Ciprofloxacin induced the expression of proteins involved in the Lex-induced SOS-response, drug efflux pumps and gene products of the ciprofloxacin-responsive prophage cluster and repressed the expression of porins and DNA-binding proteins. In study II the transcriptome and proteome of two clonal P. aeruginosa lineages during long-term colonization of cystic fibrosis (CF) patient’s lungs were analyzed. Point mutations in global regulator genes, i.e. retS, gacS, and gacA, were identified by genomic sequencing. Inactivation of RetS, found two years after the initial colonization, induced the expression of genes involved in chronic infections and coding for the type 6-secretion system (T6SS). Additional mutations in the GacS/GacA two-component regulatory system (TCS) were found to repress the expression of T6SS proteins and to induce the expression of proteins belonging to the type 3-secretion system (T3SS). In study III we elucidated the niche-specific adaptation of P. aeruginosa isolates from different infection sites by investigating their protein expression patterns and glucose metabolic fluxes. We could show that isolates from the urinary tract express a higher amount of proteins involved in the acquisition of micronutrients (i.e. iron) and carbohydrates compared to isolates from the CF lung. In study IV 16S rDNA sequencing and metaproteomics were employed to demonstrate that the investigated CAUTI-related biofilms consisted of two to five different species with one or two species dominating the mixed community. Following this line of research, we investigated in study V structure and function of a biofilm of a long-term catheterized patient, which was predominantly composed of P. aeruginosa and Morganella morganii, but also contained a minor proportion of the obligate anaerobe Bacteroides sp.. The comparison of in vivo and in vitro protein expression profiles of P. aeruginosa and M. morganii indicated that iron and carbohydrates are the major growth-limiting factors in the bladder. These results indicate different nutritional strategies of the two pathogens in the bladder environment. A comparison of urinary protein profiles of healthy persons and catheterized patients suggested that the human innate immune system is induced by CAUTIs. Moreover, numerous proteins involved in nutritional immunity, e.g. iron-, calcium- and magnesium-binding proteins, were found to be more abundant in the urine of catheterized patients. A follow-up (meta)proteomics study (study VI) aiming at the elucidation of interspecies interactions during multi-species infections indicated that the urease-positive uropathogen Proteus mirabilis induces the precipitation of metal ions by urine alkalization and thereby limits the availability of these important micronutrients for other co-infecting bacteria. This limitation seems to be sensed by the P. aeruginosa PhoP-PhoQ two-component system (TCS) leading to an increased resistance to antimicrobial peptides and biofilm-forming capacity of the pathogen. Also during co-cultivation of P. aeruginosa with Staphylococcus aureus a slight increase in the expression of the PhoP-PhoQ TCS and the alkaline protease could be observed (study VII). In study VIII a combined metagenomics and metaproteomics approach was employed to investigate structure and function of the lichen Lobaria pulmonaria, a complex consortium consisting of a fungus, an algal partner, cyanobacteria, and a highly diverse bacterial microbiome. The results presented in this work contribute to a better understanding of the manifold and complex bacterial adaptation mechanisms to infection-related and environmental stress and thereby foster the development of novel treatment and prevention strategies.
Ziel der Dissertation war die Untersuchung der physiologischen Adaptation von Staphylococcus aureus an Vancomycin und Linezolid mit Hilfe der Proteom-Analytik und die Entwicklung neuer Methoden für Proteom-Untersuchungen. Für die Untersuchung der Vancomycinstress-Antwort im ersten Teil der Doktorarbeit wurden alle vier Subproteome mit insgesamt sechs verschiedenen Methoden untersucht. Es konnte mehr als die Hälfte des theoretischen Proteoms quantifiziert werden, die Arbeit ist damit eine der umfassendsten Proteom-Studien, die bisher in S. aureus durchgeführt wurden. Es wurden verschiedene Enzyme der Biosynthese von Aminosäuren, die im Peptidoglykan-Vorläufer-Pentapeptid vorkommen, nach Vancomycin-Stress in signifikant erhöhter Menge nachgewiesen. Das ist ein Hinweis auf eine erhöhte Peptidoglykan-Synthese, wie sie auch in S. aureus Stämmen mit verminderter Vancomycin-Sensitivität beobachtet werden kann. Die Abundanz SaeRS-kontrollierter Virulenzfaktoren war nach Vancomycin-Stress vermindert. In der Vancomycin-Studie wurden extrazelluläre Proteine mit einer Trichloressigsäure (TCE)-Fällung gefällt, diese Methode ist in der Proteom-Analytik weit verbreitet. Die TCE-Fällung hat verschiedene Nachteile. Nach der Fällung muss das entstandene Pellet mehrfach gewaschen werden, hierbei kommt es zu Verlusten und die Reproduzierbarkeit sinkt. Aufgrund dieser Nachteile wurde im zweiten Teil der Dissertation ein neues Protokoll zur Anreicherung verdünnter Proteine entwickelt. Grundlage war das kommerziell erhältliche Festphasenextraktions-System StrataClean, das ursprünglich zur Entfernung von Proteinen aus PCR-Ansätzen entwickelt wurde. Im Rahmen der Doktorarbeit wurde die StrataClean-Extraktion für die gel-freie Proteom-Analytik optimiert. Der wichtigste Schritt war eine Präinkubation der StrataClean-Partikel in Salzsäure, um Kontaminationen an den Partikeln quantitativ abzubauen. Mit dem optimierten Protokoll konnten Proteine auch aus sehr stark verdünnten Lösungen (20 µg Protein in 200 ml Flüssigkeit) mit hoher Effizienz reproduzierbar angereichert werden. Diese hoch-effiziente Anreicherung ist mit keinem anderen etablierten Protokoll möglich. Zudem konnte gezeigt werden, dass die StrataClean Fällung Proteine unabhängig von ihren biophysikalischen Eigenschaften anreichert. Daher ist die StrataClean-Aufreinigung auch für absolute Quantifizierungsansätze interessant. Als weitere Anwendung können StrataClean-gebundene Proteine für mehr als 10 Tage bei Raumtemperatur gelagert werden. Das ermöglicht den Versand von Proteinproben auf dem normalen Postweg ohne aufwendige Kühlsysteme. Im dritten Teil der Doktorarbeit wurde die Linezolid-Adaptation von S. aureus USA300 analysiert. In Wachstumsversuchen konnte gezeigt werden, dass nach Linezolid-Zugabe zu exponentiell wachsenden Zellen bei OD 0.5 die Wachstumsrate sofort abnahm. Bei OD 1.6 – 2 trat ein temporärer Wachstumsarrest auf, dessen Dauer von der zugegebenen Linezolid-Konzentration abhing. Nach diesem Wachstumsarrest, der bis zu 15 Stunden anhielt, fingen die Zellen wieder an sich zu teilen. Es konnte gezeigt werden, dass die Linezolid-Konzentration im Medium während des kompletten Versuches konstant blieb. Die Hauptanpassung an Linezolid war eine verstärkte Expression der Gene ribosomaler Proteine und eine daraus folgende erhöhte Akkumulation der ribosomalen Proteine. Zudem konnte eine generelle Abnahme der Menge integraler Membranproteine und sekretierter Proteine festgestellt werden, auch wenn die Expression der codierenden Gene zunahm. Mittels elektronenmikroskopischer Analysen konnte gezeigt werden, dass die Zellen nach Linezolid-Zugabe deutlich größer wurden. Als weitere morphologische Auswirkung von Linezolid-Stress war die Dicke der Zellwand um den Faktor vier erhöht und es wurden Defekte in der Zellteilung beobachtet. Insbesondere nach Wiederaufnahme des Wachstums gab es zahlreiche zelluläre Strukturen, die mehrere, zum Teil falsch positionierte, Septen hatten. Mit Fluoreszenz-Mikroskopie wurde bewiesen, dass sich das Chromosom, das im normalen Wachstum das Cytosol ausfüllt, nach Linezolid-Zugabe komprimierte und den Kontakt zur Membran verlor. Eine Verbindung zwischen Chromosom und Membran wird durch Transertions-Komplexe gebildet. Transertion bezeichnet die simultane Transkription, Translation und Translokation integraler Membranproteine, dabei werden Komplexe aus Chromosom, mRNA, Ribosom, dem entstehendem Protein und den membranständigen SEC-Proteintransportern gebildet. Aus der Kombination der Ergebnisse wurde geschlossen, dass durch die Linezolid ausgelöste Translations-Hemmung die Transertionskomplexe aufgelöst werden und dadurch die Protein-Translokation vermindert wird. Auch die Defekte in der Zellteilung können so erklärt werden, da so das Chromosom eine Struktur-gebende Funktion für die Zellteilung verliert. Bisher war nicht vollständig bekannt, wie die strukturelle Ordnung in der Zellteilung von Staphylokokken entsteht.
Die chronische Herzinsuffizienz (HI) bezeichnet das Unvermögen des Herzens, die vom Körper benötigte Blutmenge bedarfsgerecht zu befördern und stellt in der Allgemeinbevölkerung das Endstadium vieler Herzerkrankungen dar. Trotz großer Fortschritte in der medikamentösen Therapie ist die Prognose der HI auch heute noch schlecht. Der progrediente Verlauf erstreckt sich von einer kompensierten Herzhypertrophie mit aufrechterhaltener Pumpfunktion bis hin zu einer massiven Ventrikeldilatation mit stark eingeschränkter Herzfunktion und weist dementsprechend eine schlechte Prognose auf. Die zellulären Veränderungen auf Protein- und Genexpressionsebene während der Progression einer HI sind sehr komplex und trotz ausgiebiger wissenschaftlicher Arbeiten nicht ausreichend geklärt. Dabei ist es von entscheidender Bedeutung, in welcher Phase der Erkrankung spezifische Änderungen in der Genregulation entstehen und inwiefern sich diese auf den Phänotyp auswirken. Auf Grund dessen beschäftigt sich die vorliegende Arbeit mit den zeitabhängigen Veränderungen auf mRNA-und Proteinebene während der Progression der HI. Um alle Stadien beginnend von einer subklinischen Organschädigung bis hin zur Ausbildung einer HI experimentell untersuchen zu können, wurde zunächst ein Mausmodell etabliert, welches durch eine chronische Nachlasterhöhung mittels Einengung des Aortenlumens eine Myokardschädigung durch eine arterielle Hypertonie simuliert (transverse aortic constriction, TAC). Die Herzfunktion der Mäuse wurde an den postoperativen Tagen 4, 14, 21, 28, 42, und 56 durch Messungen im Kleintier-MRT (Magnetresonanztomografie) evaluiert. Dabei konnte gezeigt werden, dass sich die linksventrikuläre Ejektionsfraktion (LVEF) TAC-operierter Mäuse vom postoperativen Tag 4 zu 14 verschlechtert, bis Tag 42 auf einem konstanten Niveau hält und bis Tag 56 nochmals stark absinkt. Im Gegensatz dazu zeigten Sham-operierte Mäuse über den gesamten Zeitraum eine stabile LVEF. Ein vergleichbarer stufenartiger Verlauf konnte bei den Parametern der linksventrikulären Masse und den endsystolischen bzw. enddiastolischen Volumina beobachtet werden. Zusätzlich konnte durch histologische Untersuchungen zu den verschiedenen postoperativen Zeitpunkten eine verstärkte Fibrosierung des Herzgewebes nach der TAC-OP aufgezeigt werden. Für die longitudinalen Transkriptom- und Proteomuntersuchungen wurden die Herzen (jeweils linke und rechte Ventrikel) nach den MRT-Messungen entnommen, gruppen- und zeitpunktspezifisch gepoolt und einer Microarray- bzw. massenspektrometrischen Analyse unterzogen. Auf Transkriptomebene zeigten sich vor allem an den Tagen 4 und 56 starke TAC-induzierte Veränderungen im Expressionsmuster, wohingegen der Zeitraum zwischen 14 und 42 Tagen weniger differenziell exprimierte Gene aufwies. Der Verlauf der Erkrankung konnte anhand bereits bekannter Hypertrophie- und HI-marker sehr gut charakterisiert werden. So zeigten Nppa (ANP) und Nppb (BNP) im linken Ventrikel bereits kurz nach Aortenstenose stark erhöhte Expressionslevel, die über die gesamte Versuchsdauer erhalten blieben. Weiterhin wurde die Expression von Genen reguliert, die an kardialen Remodelingprozessen maßgeblich beteiligt sind, wie beispielsweise Acta1 (a-Aktin), Myh7 (b-Myosin Heavy Chain) und Postn (Periostin). Im Vergleich beider Ventrikel zeigte der rechte Ventrikel bezüglich der Anzahl der regulierten Gene als auch bei der Expression HI-assoziierter Gene eine verzögerte und weniger stark ausgeprägte Reaktion. In den linken Ventrikeln wurden vor allem die Gene reguliert, deren Genprodukte der extrazelluären Matrix angehören. Eine Validierung der Microarray-Ergebnisse mittels realtime-PCR konnte die Richtigkeit der Analysemethode sehr präzise bestätigen. Da diese anhand ausgewählter Gene auf Einzeltierebene durchgeführt wurde, konnte zusätzlich auf Korrelation zwischen mRNA-Expression und den kardialen Funktionsparametern getestet werden. Wie erwartet spiegelten die Epressionslevel der HI-assozierten Markergene Nppa (ANP), Nppb (BNP) und Myh7 (b-Myosin Heavy Chain) die progressive Verschlechterung der Herzfunktion wider. Zusätzlich konnten durch die Validierung und Korrelationsanalysen weitere interessante Kandidatengene, wie beispielsweise Sfrp2 (Secreted frizzled-related protein 2) und Wisp2 (WNT1-inducible signaling pathway protein 2) für weiterführende Studien identifiziert werden. Auch auf Proteomebene konnten vergleichbare Ergebnisse erzielt werden. Auch hier zeigte der linke Ventrikel eine deutlich ausgeprägtere Reaktion auf die Drucküberlastung, der rechte Ventrikel antwortete deutlich schwächer und verzögert. Änderungen im Proteinmuster nach TAC waren in den linken Ventrikeln vor allem an den Tagen 14, 21 und 28 stark ausgeprägt. Ingenuity Pathway Analysen der veränderten Proteine weisen auf Veränderungen im Kalzium-, Rho A- und PKA-Signaling vor allem zu den frühen Zeitpunkten hin, wohingegen zu späteren Zeitpunkten hauptsächlich metabolische Prozesse betroffen waren.
This thesis will discuss the different fields of application of the two soft ionization techniques ESI and MALDI in microbial proteomics and their importance for a better understanding of bacteria physiology. The general development in the past 25 years coming from 2D-gel analysis and protein identification by peptide mass fingerprint analysis via MALDI-TOF to genome wide quantitative LC-ESI-MS experiments with fast and sensitive ESI instruments is exemplary shown for the Gram-positive bacterium Bacillus subtilis in article I. Even though 2D-PAGE in conjunction with MALDI-MS is still an important tool in proteomic research, the more recently established global quantitative LC-ESI-MS workflows gain more and more relevance as they overcome 2D-PAGE based protein restrictions and enable the acquisition of higher accurate protein quantities. In article II such a workflow was used to analyze the physiological adaptation of Staphylococcus aureus to vancomycin treatment on a global-scale. Also post-translational modifications of proteins, that are important for regulation of their activity and allow rapid adaption to changed environmental conditions, could be analyzed by LC-ESI-MS workflows using special enrichment strategies (article III and IV). Despite the mentioned discrimination and less accurate quantification of proteins, 2D-PAGE analyses are still advantageous when analyzing large-scale time series experiments. To gain highly time resolved data but also very accurate relative quantities on a global-scale, 2D-PAGE-MALDI-MS and LC-ESI-MS techniques have been combined to investigate dynamic proteome adaptations of B. subtilis during nutrition shift as part of a global systems biology approach (article V). Also absolute quantities of proteins are of high interest for systems biology, but are still challenging to obtain on large-scale as well as with sufficient accuracy. In article VI a method that again combined 2D-PAGE-MALDI-MS and LC-ESI-MS was introduced to gain absolute protein quantities on global-scale. Utilizing the complementarity of 2D-PAGE and LC-ESI-MS this new workflow enabled fast and cost efficient data acquisition on absolute scale. In article VII we described for the first time a global quantitative LC-MALDI-MS workflow. Cross validation with an LTQ Orbitrap proofed that LC-MALDI-MS is able to process complex samples and obtain highly reliable quantities. The comparative analysis of data gained with both instrument types revealed biases for certain biochemical properties of MALDI as well as ESI instruments, resulting in a general complementarity of both ionization techniques. Article I Becher, D., Büttner, K., Moche, M., Hessling, B., Hecker, M., 2011. From the genome sequence to the protein inventory of Bacillus subtilis. Proteomics 11, 2971–2980. Article II Hessling,B., Bonn,F., Herbst,F.-A., Rappen,G.-M., Bernhardt,J., Hecker,M. and Becher,D. Global proteome analysis of vancomycin stress in Staphylococcus aureus. Submitted to Mol. Cell Proteomics. Article III Elsholz, A.K.W., Turgay, K., Michalik, S., Hessling, B., Gronau, K., Oertel, D., Mäder, U., Bernhardt, J., Becher, D., Hecker, M., Gerth, U., 2012. Global impact of protein arginine phosphorylation on the physiology of Bacillus subtilis. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 109, 7451–7456. Article IV Chi, B.K., Gronau, K., Mäder, U., Hessling, B., Becher, D., Antelmann, H., 2011. S-bacillithiolation protects against hypochlorite stress in Bacillus subtilis as revealed by transcriptomics and redox proteomics. Mol. Cell Proteomics 10, M111.009506. Article V Buescher,J.M., Liebermeister,W., Jules,M., Uhr,M., Muntel,J., Botella,E., Hessling,B., Kleijn,R.J., Le Chat,L., Lecointe,F., et al. (2012) Global network reorganization during dynamic adaptations of Bacillus subtilis metabolism. Science, 335, 1099–1103. Article VI Maass, S., Sievers, S., Zühlke, D., Kuzinski, J., Sappa, P.K., Muntel, J., Hessling, B., Bernhardt, J., Sietmann, R., Völker, U., Hecker, M., Becher, D., 2011. Efficient, global-scale quantification of absolute protein amounts by integration of targeted mass spectrometry and two-dimensional gel-based proteomics. Anal. Chem. 83, 2677–2684. Article VII Hessling,B., Büttner,K., Hecker,M. and Becher,D. Global relative quantification with LC-MALDI – cross-validation with LTQ-Orbitrap proves reliability and reveals complementary ionization preferences. Submitted to Mol. Cell Proteomics.
Staphylococcus aureus is a pathogenic bacterium infecting the human host. It’s multifaced adaptation to various environmental conditions is mediated by a tight regulation of the virulence factors influencing the host’s immune system. In this thesis two regulators of gene expression were analysed: (i) the global influence of the two-component system SaePQRS and (ii) the regulation of superantigen gene expression by the alternative sigma factor σB. At the outset of this thesis, single target genes induced by SaeRS were known (hla, hlb, cap5, fnbA, coa). In order to get a general idea of the Sae-regulon, the influence of SaePQRS on gene-expression was analysed in two strain backgrounds by proteomics and transcriptomics aproaches. Recapitulatory, expression of at least 18 secreted and two covalently cell-wall bound proteins was decreased following inactivation of the Sae-system. Sae-dependently expressed were, amongst others, well decribed virulence factors like the y-hemolysins HlgA, HlgB, HlgC, LukM and LukF, the innate immune system modulating proteins Efb, CHIPS and SCIN-B as well as the enterotoxin SEB. SaeR acts as an activator of its target genes. Some proteins were detected in increased amounts in the extracellular proteome of the Sae-deficient strain. However, these changes did not occur at the transcriptional level. The expression of virulence factors is determined by other global regulators. No influence of SaePQRS on the transcription of five substancial regulators, namely the Agr-system and its effector molecule RNAIII, the alternative sigma factor σB, the two-component system ArlRS and the DNA-binding protein SarA, could be shown. In the second part of this thesis the issue was broached to the regulation of gene-expression of a subgroup of virulence factors, the superantigens (SAgs) of S. aureus by SaePQRS and σB. In contrast to their well described molecule structure and function, the regulation of their gene expression was largely unknown. Six different S. aureus strains (two laboratory strains and four clinical isolates) encoding one to seven SAg-genes each, were used for analysis of a total of twelve SAgs regarding their transcription and mitogenic activity. The transcriptional units were characterized using Northern-Blotting. The expression of SAgs could be correlated to the respective growth phase. While egc-SAgs were expressed mainly at low optical densities, seb was induced during late growth phase. In contrast, the transcription of sea, seh, sek, tst and sep remained constant and growth-phase independent. The transcriptional dataset was verified using T-cell proliferation assays. The expression of seh, tst and the egc-operon was dependent on σB. A potential σB-dependent promotor could be identified preceeding seo, the first gene of the egc-operon. In contrast, the expression of seb was increased in sigB-deficient background. This might be due to indirect effects. Expression of seb required SaePQRS. Transcriptional datasets were verified by Immuno-Blotting and T-cell-proliferation assays. In conclusion, the same mutation in sigB but in different strain backgrounds could result in opposite phenotypes with respect to their mitogenic activity. Besides well characterized virulence factors, some secreted proteins with so far unknown function belong to the Sae-regulon. Given that the influence of SaePQRS was restricted to virulence factors and induced especially modulators of the innate immune system, it can be assumed, that these proteins potentially play a role in virulence of S. aureus. In the third part of this thesis, one of these potential new virulence factors, namely SACOL0908, was analysed in detail. In cooperation with the group of Prof. Stehle, Tübingen, the crystal structure was solved. The protein folding of SACOL0908 is new with only minor similarities to described protein structures. Recombinantly expressed SACOL0908 binds to granulocytes. These cells belong to the innate immune system, incorporate bacteria by phagocytosis and kill them. The receptor for SACOL0908 on the surface of granulocytes could not be identified using immunoprecipitation, antibody-blocking assays and functional assays in cooperation with the group of Prof. Peschel, Tübingen. The gene encoding SACOL0908 was deleted in two S. aureus strain backgrounds (COL and Newman). These mutants are currently in use to characterize their phenotype in mouse-infection studies.
Non-thermal atmospheric pressure plasma has recently been shown to have broad application potential for medical as well as industrial purposes. Improved wound healing and tissue decontamination have been described as consequences of non- thermal plasma treatment. However, thus far the underlying molecular mechanisms in human tissues have only been partially characterized. In this work a two-dimensional difference in-gel electrophoresis (2D-DIGE) approach was used and an analysis-workflow to study the response of human cells to atmospheric pressure non-thermal plasma was established. Human S9 bronchial epithelial cells were used as a model for airway epithelial cells. They were treated with atmospheric pressure plasma jet (APPJ) for different periods of time. Subsequently, time-resolved comparative proteome analysis was used to study the complex cellular adaptation reactions after a 120 sec plasma treatment, which accelerated wound healing in a clinically relevant model. The results indicate, that intracellular oxidative stress due to the non-thermal plasma treatment either leads to cell death or to proliferation. The oxidative stress response, mediated by Nrf2, appears to play a pivotal role in molecular signalling and might be a key pathway determining the fate of stressed cells. This thesis demonstrates changes in Nrf2-expression after non-thermal plasma treatment. Furthermore, potential protein biomarker candidates for evaluation of oxidative stress after non-thermal plasma treatment were identified. Finally, it is shown, that the cytosolic concentrations of IL-1beta and IL-33 were decreased following non-thermal plasma treatment. Thus, modulation of innate immune response by non-thermal plasma treatment of epithelial cells (ENTplas treatment) is concluded.