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Staphylococcus aureus ist ein Gram-positives pathogenes Bakterium, welches bei ca. 30 % der gesunden Bevölkerung zur kommensalen Flora der Nasenschleimhaut gehört. Jedoch zählt S. aureus auch zu den häufigsten Erregern bakterieller Infektionen beim Menschen. Aus diesem Grund wurden S. aureus-Stämme in zahlreichen Studien untersucht, um die Pathophysiologie und Virulenz der Bakterien sowie die zugrundeliegenden Regulationsmechanismen zu verstehen. Die Expression von Virulenzfaktoren wird direkt oder indirekt durch verschiedene Regulatoren beeinflusst. Zu diesen zählen beispielsweise das Quorum-Sensing-System Agr, der alternative Sigma-Faktor SigB und das Zweikomponentensystem SaeRS. Bei der Regulation der Genexpression spielt neben Mechanismen, die die Transkriptionsinitiation beeinflussen, auch die Transkriptions-termination eine Rolle. Bei Bakterien unterscheidet man zwischen der Rho-unabhängigen und der Rho-abhängigen Transkriptionstermination. In bisherigen Studien wurde die Rolle des Transkriptionsterminationsfaktors Rho in Escherichia coli, Bacillus subtilis und Mycobacterium tuberculosis untersucht. Hierzu zählt unter anderem das Silencing von horizontal erworbenen Genen, die Verhinderung von DNA-Doppelstrangbrüchen und die Unterdrückung der persistierenden Antisense-Transkripten. Besonders die erhöhte Antisense-Transkription konnte auch in einer Tiling Array-Studie des S. aureus Wildtypstammes HG001 und einer isogenen Δrho-Mutante ST1258 festgestellt werden. In dieser Transkriptom-Analyse wurden die S. aureus-Stämme in RPMI- und TSB-Medium in der exponentiellen und stationären Wachstumsphase untersucht. Es konnten insgesamt 416 chromosomale Regionen identifiziert werden, deren Transkriptmenge in einer der vier Bedingungen in der Δrho-Mutante im Vergleich zum Wildtyp wenigstens 4-fach erhöht waren. Von diesen Regionen ließen sich nur 11 % annotierten Genen zuordnen, während eine massive Erhöhung der Menge solcher Transkripte festgestellt wurde, die vom Gegenstrang kodierender Gene stammen.
Ausgehend von diesen Befunden wurde in dieser Studie das zelluläre und extrazelluläre Proteom des S. aureus Wildtyps HG001 und der Δrho-Mutante ST1258 verglichen, um die Auswirkungen der Abwesenheit von Rho auf das Proteom zu untersuchen. Dabei lag die Mehrheit der relativ quantifizierten Proteine in erhöhten Mengen in der Δrho-Mutante im Vergleich zum Wildtyp vor. Viele dieser Proteine konnten dem SaeRS-Zweikomponentensystem von S. aureus zugeordnet werden. In der Proteomanalyse konnten 34 von 39 Proteinen, die durch SaeR reguliert werden, quantifiziert werden. Von diesen wiesen 29 erhöhte Proteinmengen in der Δrho-Mutante auf. Durch das Sae-System werden Gene reguliert, von denen die meisten für Virulenzfaktoren, wie Adhäsine, Toxine und immune evasion-Proteine, kodieren. Die Daten der Proteomanalyse zeigen, dass in S. aureus-Zellen, denen die Aktivität von Rho fehlt, das Sae-System aktiviert wird und dadurch die Induktion des SaeR-Regulons zu beobachten ist.
Die Relevanz dieser Ergebnisse wurde durch ein in vivo-Infektionsexperiment untersucht. In einem Bakteriämie-Modell führte die Inaktivierung von Rho zu einer signifikant erhöhten Virulenz von S. aureus, welche sich in einer signifikant reduzierten Überlebensrate der Mäuse äußerte. Zwischen dem Wildtyp und dem Komplementationsstamm konnte kein signifikanter Unterschied in der Überlebensrate der infizierten Mäuse gezeigt werden.
Es ist bekannt, dass SaeRS-abhängige Virulenzfaktoren auch für die Invasion in Epithel- und Endothelzellen entscheidend sind. Anhand der Zahl der internalisierten S. aureus-Bakterien nach Infektion von humanen Lungenepithelzellen konnten in dieser Arbeit keine Unterschiede zwischen dem Wildtyp HG001 und ∆rho-Mutante ST1258 im zeitlichen Verlauf festgestellt werden. Dabei konnten weder Unterschiede im Überleben in 16HBE14o- Zellen noch in der Internalisierungsrate in A549-Zellen zwischen den beiden Stämmen gezeigt werden.
Das Antibiotikum Bicyclomycin ist ein spezifischer Inhibitor des Transkriptionsterminationsfaktors Rho und wird in Studien zur Rho-abhängigen Transkriptionstermination in Gram-negativen Bakterien eingesetzt, da in diesen Rho ein essentielles Protein ist. In Transkriptom- und Proteomanalysen konnten vergleichbare Effekte durch die Behandlung des Wildtyps mit Bicyclomycin wie in der ∆rho-Mutante hervorgerufen werden. Die Antisense-Transkription und die Expression SaeRS-abhängigen Gene waren im Wildtyp nach Gabe von Bicyclomycin deutlich erhöht. Es konnte gezeigt werden, dass die Aktivierung des Sae-Systems unter Rho-defizienten Bedingungen direkt mit der Transkriptionsterminationsaktivität von Rho verbunden ist und eine neue Verbindung zwischen antibiotischer Wirkung und schädlicher Virulenzgenexpression in S. aureus herstellt werden konnte. In anderen Studien konnten Effekte von Antibiotika auf die Expression von Virulenzfaktoren in S. aureus gezeigt werden, jedoch wurden in diesen Studien die Effekte von Anti-Staphylokokken-Wirkstoffen untersucht. Im Gegensatz dazu ist im Fall von Bicyclomycin ein Antibiotikum verwendet worden, das gegen Gram-negative Bakterien wirksam ist und dennoch die Expression von Virulenzfaktoren in S. aureus beeinflusst. Diese Untersuchungen haben damit auch klinische Relevanz, nicht nur für Patienten, die an gemischten Infektionen mit verschiedenen Bakterienarten leiden, sondern auch für Patienten mit einer Gram-negativen bakteriellen Infektion, die jedoch Träger von S. aureus sind.
Streptococcus pneumoniae (pneumococci) and Staphylococcus aureus (S. aureus) are human-specific commensals of the upper respiratory tract. Every individual is asymptomatically colonized with both bacteria at least once in their life-time. The opportunistic pathogens can affect further organs and invade into deeper tissue. The occupation of normally sterile niches of the human body with the bacteria can lead to local infections such as sinusitis, otitis media and abscesses, or to life-threatening diseases like pneumonia, meningitis or sepsis. A strong interaction between the bacterium and the respiratory epithelial cells is a prerequisite for a successful colonization. This interaction is ensured by bacterial surface proteins, so called adhesins. The binding of the adhesins to the epithelial lineage occurs predominantly indirectly via components of the extracellular matrix (ECM), but also directly to cellular receptors. Pneumococci and S. aureus bind to various ECM glycoproteins, amongst others: fibronectin, fibrinogen, vitronectin, and collagen. Also binding of both pathogens to human thrombospondin-1 has been described. Thrombospondin-1 is mainly stored in the α-granula of thrombocytes (platelets) and released into the circulation upon activation. However, thrombospondin-1 is also produced and secreted by other cell types like endothelial cells, macrophages, and fibroblasts, which gets subsequently incorporated as component into the ECM. So far, no thrombosponin-1-binding adhesins of pneumococci were identified. PspC, Hic, and PavB are important surface-localized virulence factors, which were shown to interact with human ECM and plasma proteins. PspC and Hic bind to vitronectin and factor H, which inhibits the complement cascade of the human immune system. PavB interacts with fibronectin and plasminogen, and a pavB-deficient mutant of S. pneumoniae showed diminished capacity in colonization in a mouse model. Among the surface proteins of S. aureus, only Eap was identified as thrombospondin-1-binding adhesin. Beyond colonization, pneumococci and S. aureus can enter the blood circulation, interact with platelets, and cause their activation. The aggregation of platelets, especially initiated by S. aureus, plays an important role in the clinic, because most of the septic patients develop thrombocytopenia. Surface localized factors of
S. pneumoniae triggering platelet activation are unknown to date. In contrast, few proteins of S. aureus with potential to activate platelets, including Eap, were identified previously.
This study identified the surface proteins PavB, PspC, and Hic of S. pneumoniae as specific ligands of the human thrombospondin-1. Flow cytometric, surface plasmon resonance spectroscopic and immunological analyses revealed interactions between the pneumococcal proteins and soluble as well as immobilized thrombospondin-1. The use of specific pneumococcal deletion mutants verified the importance of the three virulence factors as binding partners of soluble thrombospondin-1. The results suggest that pneumococci are capable of acquiring soluble thrombospondin-1 from blood as well as utilizing immobilized glycoprotein of the ECM as substrate for adhesion. Furthermore, the thrombospondin-1-binding domain within the pneumococcal proteins was analyzed by use of recombinant fragments of PavB, PspC, and Hic. The binding capacity of thrombospondin-1 increased proportionally with the amount of repetitive sequences in PavB and PspC, and the length of the α-helical region within the Hic molecule. The binding behavior of thrombospondin-1 towards PavB and PspC is comparable with that of the ECM proteins vitronectin and fibronectin, but is unique towards Hic.
The localization of the binding domain of the adhesins within the thrompospondin-1 molecule occurred via use of glycosaminoglycans as competitive inhibitors for the interaction. The results suggest that the pneumococcal proteins Hic and PspC target the identical binding region within thrombospondin-1, which differs from the binding domain for PavB. However, all three virulence factors seem to bind in the N-terminal part of thrombospondin-1.
Two-dimensional gel electrophoresis, thrombospondin-1 overlay assay and subsequent mass spectrometric analysis identified AtlA of S. aureus as a surface localized interaction partner of human thrombospondin-1. Moreover, a vitronectin binding activity for AtlA was determined. Immunological and surface plasmon resonance binding studies with recombinant AtlA fragments revealed that interactions with both matrix proteins is mediated via the C-terminal located repeats R1R2 of the AtlA amidase domain. Binding of thrombospondin-1 and vitronectin occurred not simultaneously, due to a competitive inhibition.
The second part of the study focused on the activation of human platelets by recombinant pneumococcal and staphylococcal proteins. In total, 28 proteins of S. pneumoniae and 52 proteins of S. aureus were incubated with human platelets. The activation of the cells was detected by flow cytometry using the activation markers P-selectin and the dimerization of the integrin αIIbβIII. The proteins CbpL, PsaA, PavA, and SP_0899 of S. pneumoniae induced platelet activation, however, the detailed mechanism has to be deciphered in further studies. Furthermore, the secreted proteins CHIPS, FLIPr, and AtlA of S. aureus were discovered as inductors for the activation of platelets. In addition, the domains of AtlA and Eap, crucial for platelet activation, were narrowed down. Interestingly, CHIPS, FLIPr, and Eap were described as inhibitors of neutrophil recruitment. Platelets are recently recognized as immune cells, due to the expression of immune receptors. The data obtained in this study highlight a comprehensive spectrum of effects of the S. aureus proteins towards different type of immune cells. Besides the activation of platelets in suspension buffer and plasma, the aggregation of platelets in whole blood was triggered by the proteins CHIPS, AtlA, and Eap. These results suggest a contribution of the proteins during the S. aureus-induced infectious endocarditis. Secretion of the platelet activating virulence factors, which were identified within this study, might represent a pathogenic strategy during S. aureus infection in which a direct contact between S. aureus and platelets is not required or even avoided.
In conclusion, PavB, PspC, and Hic of S. pneumoniae and AtlA of S. aureus were identified as interaction partners of human thrombospondin-1. Furthermore, CHIPS, FLIPr, AtlA, and Eap were characterized as platelet activators. This study provides candidates for the development of protein-based vaccines, to prevent bacterial colonization and to neutralize secreted pathogenic factors.
Reversible posttranslational modifications play an important role during the regulation of many central processes in bacterial cells. Protein phosphorylation, in particular, can influence signal transduction processes and thus enables a distinct reaction of the cell to different stress and environmental conditions. In the case of the human pathogen Staphylococcus aureus, protein phosphorylation is involved in the adaptation to changing conditions during colonisation of human hosts. For this reason, the investigation of phosphorylations in S. aureus allows a better understanding of pathophysiology and virulence of this organism. Apart from stable phosphorylations at the amino acids serine, threonine and tyrosine, insights into energy-rich phosphorylations, for instance at arginine residues, gain more and more scientific attention. For this reason, one purpose of this study was the investigation of incidence and physiological relevance of this protein modification at a global scale. Firstly, the analysis of this modification was methodically optimised resulting in the identification of eight arginine phosphorylations in wild type cells of S. aureus COL. Secondly, the deletion mutant ΔptpB missing the gene that codes for an arginine phosphatase, was analysed. The characterisation of PtpB in vitro proved its activity and specificity towards arginine phosphorylations. This enabled the global analysis of the phosphoproteome with a focus on arginine phosphorylations. In addition to the optimisation of the phosphopeptide enrichment as part of the sample preparation, the data analysis process was adapted to the special challenges of energy-rich phosphorylations. Here, classical database search was extended by spectral library based analyses. In addition, synthetic peptides allow the generation of high quality mass spectra and the verification of database based evaluation strategies to ensure the quality of the spectral library. Next, S. aureus COL was cultivated under various conditions and several subcellular fractions were analysed with the aim to cover a broad part of the proteome. The combination of the spectra of synthetic peptides, the spectra of non-phosphorylated peptides from extensive cultivation experiments and the spectra of enriched phosphopeptides rendered the construction of a spectral library possible. This contained 2,270 proteins out of which 392 were found to be phosphorylated. A comparison of the database based analysis with spectral library based analysis showed the advantages of the latter when comparing the reproducibility of biological replicates. Thereby a permanent issue in phosphoproteomics was investigated. Hence, spectral libraries were used for the analysis of the phosphoproteome of S. aureus under control and stress conditions. 215 arginine phosphosites were identified within the mutant under control conditions and 117 under oxidative stress conditions. Oxidative stress was chosen because phenotypic characterisation of the mutant revealed that the most distinct growth changes in comparison with the wild type occurred after oxidative stress. These phenotypic changes were quantitatively approached in the last part of this work. Total proteome quantification of the wild type and mutant under control and stress conditions revealed an influence of the ptpB deletion on amino acid metabolism, oxidative stress response and virulence. The quantification of phosphopeptides by means of a combination of spectral library with Census based analysis finally confirmed the observations made during total proteome quantification.
Lipoproteins of Staphylococcus aureus represent a major class of surface proteins, which are anchored to the outer leaflet of the cell membrane. Although they play a key role in the immune response and virulence, the majority of lipoproteins in this organism is still of unknown function. The aim of our study was to investigate the function of so far poorly or uncharacterized lipoproteins in S. aureus strain Newman. To this end, an integrated bioinformatical approach was applied to define the pan-lipoproteome of 123 completely sequenced S. aureus strains. In total, this analysis predicted 192 different potential lipoproteins, with a core lipoproteome of 39 and a variable lipoproteome of 153 lipoproteins. Out of those 192 lipoproteins, 141 are so far functionally uncharacterized. Primarily focusing on members of the core-lipoproteome with unknown or poorly characterized function, 24 lipoproteins or co-encoded neighbor proteins were selected for further characterization. Of those 24 proteins, 20 S. aureus markerless deletion mutants were constructed (S. aureus delta l01 - delta l20) and screened for an altered growth behavior under various conditions. Here, three mutants showed a temperature-sensitive phenotype, two mutants formed aggregates in the TSB of the manufacturer Merck (TSBMerck), and four mutants showed reduced growth under osmotic stress with 8% NaCl. An altered aggregation behavior was observed for four mutants in the presence of Triton X-100 and for eleven mutants in the presence of SDS. Furthermore, ten mutants revealed an impaired biofilm formation capacity as well as reduced hemolytic activity. Interestingly, S. aureus deletion mutants delta l14 (delta NWMN_1435) and delta l16 (delta NWMN_0646) showed an altered phenotype under nearly all tested growth and stress conditions. Most strikingly, both deletion mutants demonstrated dramatic defects in cell morphology and cell division during the transient growth phase in TSBMerck and were therefore selected for further detailed characterization. Electron microscopy imaging of the two mutants revealed an irregular cell shape, increased cell size, multiple displaced division septa, and incomplete separation of daughter cells resulting in the formation of cell aggregates in TSBMerck. Complementarily, microarray-based transcriptome analysis and whole-genome sequencing of S. aureus delta l14 and delta l16 suppressor mutants strongly point to a functional association of both lipoproteins with cell envelope- or cell division-related processes. Specifically, multiple hints suggest a functional connection of both lipoproteins with lipo- or wall teichoic acids. Of note, the phenotypes of S. aureus delta l14 and delta l16 are conditional and appear under some, but not all growth conditions. Thus, it is conceivable that the function of L14 and L16 is modulated by metabolic processes, or that the proteins might be part of a “backup system” becoming important only under certain conditions. Collectively, we propose that L14 and L16 fulfill a basic role in cell envelope- or cell division-related processes under specific growth conditions. Particularly, the activity of L14 and L16 might be necessary for the function or localization of lipo- or wall teichoic acids, and thus, might be linked to the regulation of autolysins. In conclusion, this study reveals important insights into the function of two so far uncharacterized but highly conserved lipoproteins in S. aureus.
Neue Antibiotika und Präventionsmaßnahmen gegen S. aureus sind aufgrund der starken Ausbreitung multiresistenter S. aureus-Stämme dringend erforderlich. Zur Entwicklung von Therapie- und Präventionsmaßnahmen werden geeignete Infektionsmodellen benötigt, die die klinische Situation möglichst exakt widerspiegeln. Da die Spezies S. aureus stark wirtsspezifisch ist, könnten wirtsadaptierte S. aureus-Stämme hierbei äußerst hilfreich sein. In der Infektionsforschung werden vor allem Mausmodelle verwendet. Da bisher jedoch angenommen wurde, dass Mäuse keine natürlichen Wirte von S. aureus sind, sind S. aureus-Forscher davon ausgegangen, dass Mäuse kein geeignetes Modell darstellen. Das wurde durch unsere und andere Arbeitsgruppen allerdings in den letzten Jahren widerlegt. Wir konnten zeigen, dass Labor- und Wildmäuse mit S. aureus besiedelt sind.
Im Rahmen dieser Arbeit sollte geklärt werden, ob murine Infektionsmodelle durch die Verwendung von mausadaptierten S. aureus-Stämmen optimiert werden können. Aus über 250 S. aureus-Stämmen, die aus Labor und Wildmäusen isoliert wurden, wurden vier mausadaptierte S. aureus-Isolate ausgewählt und mit dem humanen S. aureus-Isolat Newman in einem Pneumonie- und Bakteriämiemodell vergleichen. Diese Stämme wiesen einen repräsentativen spa-Typ sowie typischen Phagenmuster und Virulenzgene auf. Zudem waren sie in der Lage, murines Plasma zu koagulieren und in murinem Vollblut zu replizieren.
Es zeigte sich, dass das murine Isolat S. aureus DIP sowohl im Pneumonie- als auch im Bakteriämiemodell deutlich virulenter war als das humane Isolat Newman und die anderen getesteten mausadaptierten Stämme. Nach kürzester Zeit starben alle Tiere, die mit S. aureus DIP infiziert wurden. Wurde die Infektionsdosis im Vergleich zu Newman um 90 % reduziert, waren die bakterielle Last, der Belastungsscore, sowie die Zytokin- und Chemokinkonzentrationen nach Infektion mit S. aureus DIP bzw. S. aureus Newman vergleichbar. Im Besiedlungsmodell konnte gezeigt werden, dass die mausadaptierten Stämme S. aureus JSNZ sowie S. aureus DIP in der Lage sind, Mäuse über einen Zeitraum von 7 Tagen stabil zu besiedeln. Mäuse, die mit S. aureus Newman besiedelt waren, konnten den Stamm innerhalb dieses Zeitraums eliminieren. Die Genomsequenzierung der in vivo verwendeten S. aureus Stämme zeigte, dass lediglich S. aureus DIP für das Leukozidin LukMF‘ kodiert. Das lässt vermuten, dass die Präsenz des Virulenzfaktors für die gesteigerte Virulenz von S. aureus DIP verantwortlich sein könnte.
Des Weiteren sollten in dieser Arbeit ein Besiedlungsmodell mit murinen S. aureus-Isolaten etabliert und die beteiligten Immunzellen quantifiziert werden. Es zeigte sich, dass Mäuse mit murinen S. aureus-Isolaten bis zu 7 Tage besiedelt werden können wohingegen S. aureus Newman zu diesem Zeitpunkt nur noch in 20 % der Tiere nachweisbar war. Zudem konnte bei der intranasalen Besiedlung mit einer hohen Dosis S. aureus DIP [1 × 10^8 CFU] gezeigt werden, dass sowohl Th17-Zellen als auch γδ-T-Zellen nach 7 Tagen IL-17A, IL-17F und IL-22 produzieren. Jedoch konnte die Zytokinproduktion nur in Tieren nachgewiesen werden, die einen hohen Belastungsscore aufwiesen. Da nach 24 Stunden bei Tieren mit hohem Belastungsscore auch Bakterien in der Lunge detektiert wurde, ist anzunehmen, dass S. aureus diese Tiere nicht nur besiedelt, sondern bei ihnen auch eine Atemwegsinfektion verursacht hatte. Durch den geringen prozentualen Anteil an ILCs in den zervikalen Lymphknoten war es nicht möglich Rückschlüsse auf deren Zytokinproduktion zu ziehen. Somit gelang es zwar ein murines S. aureus-Besiedlungsmodell zu etablieren, jedoch kann keine Aussage zu den beteiligten Zellen des Immunsystems getroffen werden.
Zusammenfassend konnte gezeigt werden, dass Labormäuse mit mausadaptierten S. aureus-Stämmen länger besiedelt werden können als mit dem humanen Referenzstamm Newman. Zudem konnte mit Hilfe des mausadaptierten Stammes S. aureus DIP die Infektionsdosis im Pneumonie- und Bakteriämiemodell erheblich reduziert werden. Somit gelang es Mausmodelle durch die Verwendung von mausadaptierten S. aureus-Stämmen zu optimieren, auch wenn das nicht auf alle getesteten Isolate zutrifft. Durch die Anpassung an den murinen Wirt stellen mausadaptierte S. aureus-Stämme wie DIP und JSNZ ein physiologischeres Modell der Pathogen-Wirts-Interaktion dar. Die Verwendung eines solchen Stammes ermöglicht es ein besseres Verständnis für Infektionsprozesse und die Pathogen-Wirt-Interaktionen zu erlangen und dadurch eventuell neue Therapiemöglichkeiten zu entwickeln.
Es ist zu berücksichtigen, dass auch die Verwendung mausadaptierter S. aureus-Stämme in murinen Besiedlungs- und Infektionsmodellen lediglich ein Modell darstellt, welches Vor- und Nachteile hat. Daher ist es essenziell, dass Wissenschaftler die Grenzen jedes Modellsystems kennen und das richtige Infektionsmodell (oder eine Kombination davon) auswählen, um ihre Forschungsfragen zu beantworten.
Staphylococcus aureussuperantigens (SAgs) are among the most potent T cell mitogensknown.They stimulate large fractions of T cells by cross-linking their T cell receptor withmajor histocompatibility complex class-II molecules on antigen presenting cells, resulting in Tcell proliferation and massive cytokine release. To date, 26 different SAgs have been described in thespeciesS. aureus; they comprise the toxic shock syndrome toxin (TSST-1), as well as 25 staphylococcalenterotoxins (SEs) or enterotoxin-like proteins (SEls). SAgs can cause staphylococcal food poisoningand toxic shock syndrome and contribute to the clinical symptoms of staphylococcal infection. Inaddition, there is growing evidence that SAgs are involved in allergic diseases. This review providesan overview on recent epidemiological data on the involvement ofS. aureusSAgs and anti-SAg-IgEin allergy, demonstrating that being sensitized to SEs—in contrast to inhalant allergens—is associatedwith a severe disease course in patients with chronic airway inflammation. The mechanisms by whichSAgs trigger or amplify allergic immune responses, however, are not yet fully understood. Here, wediscuss known and hypothetical pathways by which SAgs can drive an atopic disease
Staphylococcus aureus(S. aureus) is a pathobiont of humans as well as a multitude of animalspecies. The high prevalence of multi-resistant and more virulent strains ofS. aureusnecessitatesthe development of new prevention and treatment strategies forS. aureusinfection. Major advancestowards understanding the pathogenesis ofS. aureusdiseases have been made using conventionalmouse models, i.e., by infecting naïve laboratory mice with human-adaptedS. aureusstrains. However,the failure to transfer certain results obtained in these murine systems to humans highlights thelimitations of such models. Indeed, numerousS. aureusvaccine candidates showed promising resultsin conventional mouse models but failed to offer protection in human clinical trials. These limitationsarise not only from the widely discussed physiological differences between mice and humans, but alsofrom the lack of attention that is paid to the specific interactions ofS. aureuswith its respectivehost. For instance, animal-derivedS. aureuslineages show a high degree of host tropism and carry arepertoire of host-specific virulence and immune evasion factors. Mouse-adaptedS. aureusstrains,humanized mice, and microbiome-optimized mice are promising approaches to overcome theselimitations and could improve transferability of animal experiments to human trials in the future.
Staphylococcus aureus (S. aureus) is among the most common infectious agents, burdening the
global health care system and challenging physicians. Thus, the demand for vaccination is
increasing, and despite many attempts, no vaccine is currently available. The iron-regulated
surface determinant protein B (IsdB) is a highly conserved surface protein of S. aureus. It has
an essential role in bacterial iron acquisition and cell attachment, functioning as a fitness factor.
It has been shown that IsdB is critical for S. aureus virulence and growth in iron-restricted
conditions, such as the human host. Therefore, IsdB was studied as a vaccine candidate. A nonadjuvant vaccine (V710) was developed based on IsdB, which showed promising results in the
preclinical, phase I, and phase IIa trials. Unexpectedly, in a phase IIb/III, in cardiothoracic
surgery patients that were infected by S. aureus, mortality was significantly higher in the
vaccinated group than the placebo. Despite increased antibody levels against IsdB in the
vaccinated patients, V710 failed to prevent S. aureus infection. Therefore, a better
understanding of the interaction between S. aureus and the immune system is required.
We have discovered that IsdB has an important role in host-pathogen interaction. This bacterial
protein activated human monocytes and murine bone marrow-derived dendritic cells
(mBMDCs) to produce proinflammatory cytokines, such as IL-6, TNF-α, IL-12, IL-23, IL-33,
and IL-1β. In silico molecular docking and DimPlot analysis predicted that IsdB binds to -TLR4
via non-covalent interactions. Microscale thermophoresis confirmed that IsdB has a high
affinity to recombinant human TLR4 in the nanomolar range. Inhibition of TLR4 completely
abolished the production of all the cytokines mentioned above in both cell types. Furthermore,
we characterized the TLR4 signaling pathway triggered by IsdB. In human monocytes, blocking
the myeloid differentiation factor 88 (MyD88) adaptor protein and NF-κβ transcription factor
caused complete abrogation of proinflammatory cytokines in response to IsdB, revealing that
IsdB induces cytokine release via the TLR4-MyD88-NF-κβ dependent pathway.
The consistent release of IL-1β suggested that IsdB induced activation of the inflammasome, a
multi-molecular complex known to play a crucial role in innate immunity. We corroborated our
observations in human monocytes and mBMDCs by inhibiting essential components of the
NLRP3 inflammasome. Blocking NLRP3, caspases in general and caspase-1 completely
inhibited the release of IL-1β. In monocytes, IsdB alone was sufficient to induce NLRPdependent IL-1β release, suggesting an alternative pathway of inflammasome activation. In
contrast, mBMDCs required an additional stimulus, such as ATP or MSU (known stress
signals) besides IsdB, to release IL-1β, indicating a classical inflammasome activation. These
results demonstrate that IsdB induces the release of IL-1β via the TLR4-NLRP3-Caspase-1
axis. Next, we addressed the molecular mechanisms involved in IsdB-induced IL-1β in monocytes.
A low concentration of intracellular potassium (K+) resulting from K+ efflux is known to trigger the NLRP3 inflammasome-mediated IL-1β release. We demonstrated that blocking potassium efflux by inhibition of ion channels, such as pannexin channels (P2X)7, and addition of extracellular KCl significantly reduced IsdB-induced IL-1β. Other common inflammasome activators, such as phagolysosome rupture and reactive oxygen species (ROS), did not contribute to the release of IL-1β in response to IsdB. In summary, we revealed yet another role of IsdB beyond iron acquisition from Hb and attachment to the host cells via vitronectin and integrins. It is conceivable that IsdB’s interaction with innate immune cells modulates the quality of the adaptive immune response, showing a new facet in the pathogen-host relationship of S. aureus that should be considered in future
vaccine development.
Hintergrund: Wie in vielen anderen Bereichen der Medizin kann ein Methicillin-resistenter Staphylococcus aureus (MRSA) auch zahnmedizinisches Personal sowie ihre Patient*innen besiedeln. Studien zur Prävalenz von MRSA und Methicillin-sensiblem S. aureus (MSSA) bei dieser Berufsgruppe sowie zum Trageverhalten bei persönlicher Schutzausrüstung (PSA) sind jedoch rar.
Ziel: Es wurde eine Beobachtungsstudie (StaphDent Studie) durchgeführt, um die Prävalenz von MRSA und MSSA bei Zahnärzt*innen und zahnärztlichem Personal in der Region Mecklenburg-Vorpommern zu bestimmen. Des Weiteren sollte die Compliance zum Einhalten der Hygienemaßnahmen anhand des Trageverhaltens von PSA ausgewertet werden, um daraus mögliche Rückschlüsse in Bezug auf die Prävalenz von MRSA und MSSA ableiten zu können.
Methoden: Von Zahnärzt*innen (n= 149), zahnärztlichem Personal (n= 297) sowie von weiteren Praxisangestellten wurden zum größten Teil im Selbsttestverfahren Nasenabstriche entnommen. Es erfolgte die Auswertung im Fachbereich Mikrobiologie. Die klonale Verwandtschaft der MSSA-Isolate wurde durch spa-Typisierung und in einigen Fällen durch Ganzgenomsequenzierung charakterisiert. Die Verwendung von PSA wurde anhand eines Fragebogens ermittelt.
Ergebnisse: Während 23,7% (115/485) der Teilnehmenden mit MSSA kolonisiert waren, konnte MRSA in keiner der Proben nachgewiesen werden. Die MSSA-Prävalenz steht in keinem statistischen Zusammenhang mit der Praxisgröße, dem Geschlecht, dem Alter oder der Dauer der Beschäftigung. Die identifizierten 61 spa-Typen ließen sich 17 klonalen Komplexen und vier Sequenztypen zuordnen. Die meisten spa-Typen (n= 51) wurden nur einmal nachgewiesen. In 10 Zahnarztpraxen trat ein spa-Typ zweimal auf. Die Ganzgenomsequenzierung bestätigt eine enge klonale Beziehung für 4/10 dieser Isolatpaare. PSA wurde von den meisten Zahnärzt*innen und ihren Mitarbeitern und Mitarbeiterinnen regelmäßig verwendet.
Schlussfolgerung: Der fehlende Nachweis von MRSA spiegelt die geringere MRSA-Prävalenz in dieser Berufsgruppe wider. Das zum größten Teil konsequente Tragen der PSA und die damit verbundene hohe Compliance bei der Einhaltung der Hygienemaßnahmen scheinen für dieses Ergebnis ursächlich zu sein.
Das alpha-Toxin (Hla) von Staphylococcus aureus (S. aureus) spielt eine bedeutende Rolle bei S. aureus-induzierten Pneumonien. Hla bindet zunächst als Monomer an die Plasmamembran eukaryotischer Wirtszellen und assoziiert sich zu heptameren Transmembranporen. Die Sensitivität gegenüber dem Toxin ist bei verschiedenen Atemwegsepithelzelllinien unterschiedlich ausgeprägt. Die Gründe dafür sind bis jetzt nicht vollends verstanden. Mögliche Faktoren, die einen Einfluss auf die Hla-Sensitivität der Zellen haben, könnten die Rezeptordichte und Effizienz der Porenbildung sowie die Entsorgung von Poren aus der PM durch Internalisierung und Degradation (lysosomal, proteasomal) oder durch Ausschleusung von extrazellulären Vesikeln in den Extrazellularraum sein.
Ziel dieser Arbeit war es, die Bedeutung der Faktoren, die einen Einfluss auf die Toxin-Sensitivität von Wirtszellen haben könnten, am Beispiel der drei Atemwegs-Modellzelllinien 16HBE14o-, S9 sowie A549 genauer zu untersuchen.
Dabei konnte gezeigt werden, dass die Menge an rHla, allem voran die Abundanz der Heptamere in der Plasmamembran der Zellen, einen starken Einfluss auf die Toxinsensitivität (gemessen an der Rate parazellulärer Lückenbildung in den Zellverbänden) der Zelllinien hat. Diese Ergebnisse korrelierten am besten mit der Häufigkeit des potenziellen Hla-Rezeptors ADAM10 in der Plasmamembran der drei Zelltypen, aber auch das Phospholipid Sphingomyelin scheint ebenfalls einen Einfluss auf die Hla-Sensitivität der Zellen zu haben. Die Zellgröße, der für die Hla-Vorpore stabilisierende Faktor Caveolin-1, Integrin α5β1 als weiterer möglicher Hla-Rezeptor und die Lipide Phosphatidylcholin/-serin zeigten dagegen keine Korrelation zur Hla-Sensitivität der drei Atemwegsepithelzelllinien. Das Lipid Phosphatidylethanolamin wies zwar das gleiche Muster wie das des Sphingomyelins bei den Zelllinien auf, jedoch muss eine mögliche Bedeutung des Lipids in der Hla-Bindung und/oder -Heptamerisierung erst noch untersucht werden.
Untersuchungen der Internalisierung des Toxins zeigten, dass von den drei Atemwegsepithelzelllinien nur die S9-Zellen in der Lage waren die rHla-Heptamere effizient zu internalisieren. Dabei konnte unter Verwendung der rHla-Mutante rH35L, die keine Transmembranpore ausbilden kann, gezeigt werden, dass die Internalisierung der Toxin-Heptamere wahrscheinlich Poren-unabhängig geschieht. Durch die Überprüfung des rHla-Abbaus in S9-Zellen nach Inhibierung der lysosomalen oder proteasomalen Proteindegradation konnte ein Abbau des Toxins über das Proteasom ausgeschlossen werden. Dagegen scheint der lysosomale Weg von entscheidender Bedeutung für die Hla-Heptamer-Degradation zu sein. Eine saure Hydrolyse der Protease-resistenten Toxin-Heptamere in rHla-Monomere konnte allerdings nicht nachgewiesen werden und scheint somit bei dem lysosomalen Abbau keine Rolle zu spielen. Präparierte extrazelluläre Vesikel von rHla-behandelten S9-Zellen zeigten zudem, dass eine Entsorgung des Toxins über Exosomen und/oder Mikrovesikel ebenfalls bei diesen Zellen möglich zu sein scheint. Der primäre Weg der Hla-Prozessierung ist bei den S9-Zellen dennoch der lysosomale Abbau.