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Der Kernaustritt der Nukleokapside stellt einen essentiellen Schritt im Replikationszyklus der Herpesviren dar. Aufgrund seiner Größe kann das Kapsid den Kern nicht durch die Kernporen verlassen, sondern wird durch die Kernmembranen transportiert. Die viralen Proteine pUL34 und pUL31 bilden den NEC (nuclear egress complex), der virale und zelluläre Kinasen an die Kernmembran rekrutiert. Diese phosphorylieren die Lamine, wodurch sich die Lamina partiell auflöst und das Nukleokapsid Zugang zur Kernmembran erhält. Die Deletion einer oder beider Komponenten des NEC bewirkt zwar eine deutliche Reduktion der viralen Titer, jedoch wird eine geringe Menge infektiöser Nachkommenviren freigesetzt, die für eine Reversionsanalyse genutzt wurde. Dafür wurde zuerst das UL34-negative Virus und später auch das UL31-negative Virus, auf Kaninchennierenzellen (RK13) seriell passagiert, bis im Überstand Wildtyp-ähnliche Titer erreicht wurden. Aus diesen Überständen wurden Virusmutanten isoliert, die ohne den NEC effizient replizierten und als PrV-ΔUL34Pass bzw. PrV-ΔUL31Pass bezeichnet wurden. Elektronenmikroskopische Aufnahmen zeigten, dass die passagierten Viren nicht mehr wie der PrV-Wildtyp durch die Kernmembran transportiert, sondern durch eine partiell aufgelöste Kernmembran ins Zytoplasma freigesetzt wurden. Das Ziel dieser Arbeit war zu untersuchen, wie die Freisetzung der Kapside aus dem Kern ohne den essentiellen NEC abläuft. Um zu ermitteln, welche viralen Proteine für die Auflösung der Kernmembran von Bedeutung sein könnten, wurde zunächst das komplette Genom von PrV-ΔUL34Pass sequenziert und mit dem des Wildtyps (PrV-Ka) und der nicht passagierten UL34-Deletionsmutante (PrV-ΔUL34) verglichen. Die mutierten Gene wurden anschließend in PrV-ΔUL31Pass sequenziert. Zu den sieben Genen, die in beiden passagierten Viren verändert sind, gehören u.a. UL21, UL26, UL46 und UL49. Jedoch konnte durch Deletion der einzelnen mutierten Gene nicht geklärt werden, welches Genprodukt für die Kernmembran-Fragmentierung in PrV-ΔUL34Pass- oder PrV-ΔUL31Pass infizierten Zellen bzw. für die Stabilisierung der Kernmembran während der Wildtyp-Infektion verantwortlich ist. Mit Hilfe von Inhibitorstudien wurde untersucht, welche zellulären Prozesse von den passagierten Viren manipuliert werden könnten, um die Kernmembran-Fragmentierung zu induzieren. Der Cdk (Cyclin dependent kinase) 1, Cdk2 und Cdk5-Inhibitor Roscovitin, der in höheren Dosen auch ERK1/2 (extracellular regulated kinase 1/2) hemmt, reduzierte die Titer der passagierten Viren deutlich, während der PrV-Wildtyp kaum beeinflusst wurde. Einen ähnlichen Effekt konnte auch mit einem Inhibitor für die ERK1/2 vorgeschaltete Kinase MEK1/2 (mitogen activated protein kinase/ERK kinase 1/2) erzielt werden. Spezifische Inhibitoren von ERK1/2, Cdk1, Cdk2 oder Cdk5 zeigten jedoch keinen spezifischen Einfluss auf die passagierten Virusmutanten oder den Wildtyp. Zur selben Zeit konnte eine andere Arbeitsgruppe zeigen, dass das Varizella Zoster Virus pUL46 Homolog ORF12 die Aktivierung von ERK1/2 induziert (Liu et al., J. Virol. 86, 2012). Basierend auf dieser Studie wurde untersucht, ob PrV pUL46 ebenfalls ERK1/2 aktivieren kann und ob diese Aktivierung für die Auflösung der Kernmembran von Bedeutung ist. Es konnte gezeigt werden, dass sowohl PrV-Wildtyp als auch PrV-ΔUL34Pass pUL46 ERK1/2 und die entsprechenden Zielgene aktivierte. Die Deletion von UL46 aus dem Genom der passagierten Viren resultierte außerdem in einem deutlich höheren Anteil von Zellen mit einer fragmentierten Kernmembran, wobei dies nicht ausschließlich auf die Aktivierung von ERK1/2 durch pUL46 zurückgeführt werden kann, da sich die beiden passagierten Viren in ihrem ERK-Aktivierungspotential unterscheiden. Während PrV-ΔUL31Pass ERK1/2 vergleichbar zum Wildtyp induzierte, war die Aktivierung durch PrV-ΔUL34Pass deutlich geringer. Diese Abweichung lässt sich nicht auf die unterschiedlichen pUL46-Proteine der beiden passagierten Virusmutanten zurückführen, da der Austausch der jeweiligen UL46 Sequenzen gegen Wildtyp UL46 das ERK1/2-Aktivierungsmuster nicht veränderte. Somit scheint pUL46 einen Einfluss auf die Stabilität der Kernmembran und die Aktivierung von ERK zu haben. Beide passierte Viren bilden verstärkt Synzytien im Vergleich zum PrV-Wildtyp oder den nicht-passagierten Vorläufern aus. Um zu untersuchen, ob diese Deregulierung der Membranfusion auch die Kernmembranen betrifft und möglicherweise eine Ursache für die Fragmentierung sein könnte, wurden die Glykoproteine gB und gH aus den Genomen der passagierten Virusmutanten deletiert. Elektronenmikroskopische Aufnahmen sowie Untersuchungen von Replikationsverhalten und Plaquebildung ergaben, dass die Fragmentierung der Kernmembran auch in Abwesenheit von gB oder gH stattfindet. Dagegen sind beide Glykoproteine, wie auch im PrV-Wildtyp, für die Virusreplikation essentiell.

Kapitel 1 beschreibt Untersuchungen zu der Fragestellung, ob Matrixalterung eine Ursache für Massebilanzdefizite sein kann. Diese Vermutung blieb bislang in der Literatur unberücksichtigt und wurde nun anhand einer breit angelegten Studie überprüft. Verschiedene Fertigarzneimittel und für die Studie entwickelte Formulierungen mit PCA und E2 wurden in Klimakammern und Trockenschränken gelagert, um unterschiedliche Alterungszustände der Formulierungsmatrices zu simulieren. In definierten Zeitabständen wurden Proben hinsichtlich der PCA- und E2-Wiederfindung analysiert. Ausgewählt wurden Formulierungen mit geringen Konzentrationen der Modellsubstanzen, da dies als worst-case angesehen wurde und auch die Anforderungen für die Aufklärung von Massebilanzdefiziten bei sehr gering dosierten Arzneimitteln stetig steigen. Im vorliegenden Fall konnte bei 67 % aller untersuchten Proben eine signifikante Änderung der Wiederfindung und somit eine potentielle Ursache für Massebilanzdefizite festgestellt werden. Tritt in der Praxis ein Massebilanzdefizit auf, das mithilfe der etablierten Lösungsansätze nicht aufzuklären ist, so ist die Überprüfung der Wiederfindung der betreffenden Substanz aus der gealterten Matrixstruktur sinnvoll und kann unter Umständen eine Optimierung und ggf. Revalidierung der analytischen Methode erforderlich machen. Ausgangsgedanke für Kapitel 2 war die Tatsache, dass die chromatographische Trennung eines Arzneistoffes und aller seiner Abbauprodukte für die Aufstellung einer lückenlosen Massebilanz entscheidend ist. Die E2-Abbauprodukte delta6- und delta9,11-E2 konnten bislang im Rahmen von Stabilitätsstudien mit E2-Formulierungen nicht separat quantifiziert werden. Zum Teil wird in der Literatur delta6-E2 als Abbauprodukt, delta9,11-E2 jedoch mit dem Verweis auf sehr ähnliche Retentionszeiten lediglich als Syntheseverunreinigung angesehen, was im Gegensatz zu praktischen Erfahrungen und Untersuchungen von Vertretern der pharmazeutischen Industrie steht. Das Kapitel 2 beschreibt die Entwicklung einer chromatographischen Trennmethode für E2 und die Abbauprodukte 6alpha-E2, 6beta-E2, 6-Keto-E2, delta6-E2, beta-Equilenol und delta9,11-E2. Die Trennung aller Komponenten wurde mittels einer Hochleistungsflüssigchromatographie (HPLC) unter der Verwendung einer pentafluorphenylierten Kieselgelphase realisiert. Praktische Anwendung konnte anhand des Marktproduktes Vagifem® gezeigt werden, für welches aufgrund der niedrigen Arzneistoffkonzentration und sehr komplexen Tablettenmatrix zunächst die Entwicklung einer geeigneten Probenvorbereitung durchgeführt wurde. Abschließend wurde die Methode hinsichtlich Selektivität, Sensitivität, Linearität, Präzision und Richtigkeit validiert. Kapitel 3 nimmt Bezug auf die Arzneimittelsicherheit von Fertigarzneimitteln unter analytischen Gesichtspunkten. Die Identität und der Verbleib eines Arzneistoffes und aller seiner Abbauprodukte sind bei der Lagerung von Arzneimitteln nicht nur unter dem Aspekt der Massebilanz von Bedeutung. Entstehen während der Lagerung genotoxische Abbauprodukte, müssen diese in engen Grenzen überwacht werden. Diese Aspekte wurden anhand des Fertigarzneimittels Paludrine® (Arzneistoff Proguanil) verdeutlicht. Zunächst wurde der Übergang des genotoxischen Abbauproduktes PCA in die Gasphase während der Lagerung bei erhöhten Temperaturen überprüft. Simultan wurde der Anstieg von PCA sowie der Proguanilgehalt in den Tabletten bestimmt, um Rückschlüsse auf die Massebilanz zu erhalten. Es konnte gezeigt werden, dass PCA unter den gewählten Bedingungen in der Gasphase über den Tabletten nachweisbar war. Der entsprechende Gehalt war jedoch in Relation zum PCA-Gehalt und Proguanilgehalt in den Tabletten vernachlässigbar gering. Ein Einfluss auf die Massebilanz konnte folglich ausgeschlossen werden. Für eine Massebilanz entscheidend sind weiterhin Kenntnisse über alle Abbauprodukte. Im Fall von Proguanil lieferte die Literatur Hinweise auf bislang unidentifizierte Abbauprodukte, für welche Strukturvorschläge erarbeitet wurden. Im Hinblick auf die Genotoxizität des Hauptabbauproduktes PCA, wurden auch für die neu vorgeschlagenen Strukturen erste toxikologische Bewertungen mittels DEREK, MCASE und Vitic erstellt. Abschließend wurde die Anwesenheit von allen Abbauprodukten in künstlich gealterten Tabletten überprüft.